小肽螯合铁缓解樱桃萝卜苗期高温胁迫的生理机制

2019-09-12贾春花张林琳刘之广孙玲丽

植物营养与肥料学报 2019年8期

贾春花，张林琳，张民,*，刘之广*，郑磊，孙玲丽，孙正

[1 土肥资源高效利用国家工程实验室/山东农业大学资源与环境学院，山东泰安 271018；2 养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室/金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沭 276700；3 众德肥料 (平原) 有限公司，山东平原 253100；4 中国海洋大学，山东青岛 266005]

樱桃萝卜 (Raphanus sativusL. var.radculusPers.)是中国主要的四季萝卜之一，生育期短，外形、色泽美观，口感爽脆，营养丰富，单位面积产量高，经济效益好。樱桃萝卜最适生长温度为5～25℃，不耐炎热，在高温环境中生长受阻、易发生病虫害，产量低、品质差。农业生产中，樱桃萝卜温室栽培极易受高温胁迫。高温胁迫会改变植物细胞膜结构，使膜上不饱和脂肪酸含量增加、蛋白质失活，进而损伤磷脂双分子层流动性，影响膜脂的三级及四级结构等[1]。另外，高温胁迫可破坏叶绿体中的电子运输，改变能量分布，影响与碳代谢相关酶的活性，尤其是Rubisco酶[2]，同时引起活性氧爆发[3-4]，导致膜脂过氧化反应和电解质外渗，影响植物正常的光合作用和生长发育[5]。因此，探究可提高樱桃萝卜耐热性的生物刺激素并研究其抗热机理，对实现樱桃萝卜的优质生产与均衡供应、缓解夏季果蔬供应不足具有重要的现实意义[6]。前人研究表明，小肽螯合铁是一种来源于玉米蛋白的新型生物刺激素，有效成分为仿生内源肽及有机螯合铁，其双分子螯合结构与作物体内酶的活性中心铁的存在形式类似。有研究表明，玉米肽具有良好的清除羟基自由基和DPPH自由基的能力及还原能力[7-8]，可显著提高作物养分吸收和利用效率，提高作物抗氧化能力[9]。而芸苔素内酯是一种常见的含催化平衡成分和氨基酸类化合物的生物刺激素，具有提高作物抗逆性、改良农产品品质和增加产量等作用，已获得市场的认可并广泛应用[10]。徐静等[11]研究表明，喷施30～60 mg/kg的6.003%氨基·芸苔素内酯水剂可显著提高芒果产量及品质，应用前景广阔。目前关于小肽螯合铁对高温胁迫下作物耐热性调控方面的研究尚未见报道。因此本研究以芸苔素内酯为阳性对照，研究高温胁迫下小肽螯合铁对樱桃萝卜内源激素水平、抗氧化系统及光合系统的影响，探讨小肽螯合铁对樱桃萝卜抗氧化系统影响的生理机制及其对内源激素的调控作用，为缓解樱桃萝卜高温胁迫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在山东省泰安市山东农业大学土肥资源高效利用国家工程实验室进行。

供试樱桃萝卜种子来源于荷兰BEJO公司，生长期45天。

供试生物刺激素为芸苔素内酯粉剂，干物质量为0.136%，来源于上海拜诺国际生物科技进出口公司；小肽螯合铁 (结构式如图1) 来源于山西北正农生物工程有限公司，制备过程为将玉米蛋白通过酶解获取含甘氨酸和蛋氨酸的肽片段，灭活除杂后过分子筛获取含1000～1100分子量的肽类物质，经其与铁元素螯合浓缩后制得水剂成品，干物质量为80 g/L。

图 1 小肽螯合铁结构式Fig. 1 Structural formula of peptide-chelated iron

供试基质为蔬菜育苗基质，来源于丹麦品氏托普公司，基本理化性质为有机质434 g/kg、NO3--N 296 mg/kg、NH4+-N 84.1 mg/kg、有效磷99.2 mg/kg、速效钾1169 mg/kg、pH值5.94(水基质比5∶1)、电导率 2180 μS/cm(水基质比 5∶1)。

供试育苗采用梯形方盒，上口边长10 cm、高8 cm、底面边长7 cm。自配营养液为氮、磷、钾比例为20∶10∶20的育苗专用肥1000倍的水溶液[12]。

1.2 试验设计

试验共设6个处理 (表1)，3次重复，置于光照培养箱 (宁波江南仪器厂) 内，昼夜温度设置为(30 ±1)℃，常温对照温度为(25 ± 1)℃，相对湿度通过加湿器维持在50%～60%，光照强度约15000 lx，每天设定光照16 h[12]。

表1 试验处理Table 1 Treatments for experiment

试验于2018年3月20日至4月17日进行。浸种时选取大小一致、籽粒饱满的萝卜种子，分别置于不同浓度的两种供试生物刺激素稀释液中 (表1)，于25℃恒温培养5小时。浸种结束后于30℃恒温培养箱进行培养，并设置25℃常温空白对照。分别播种2粒樱桃萝卜种子于装满供试基质的育苗方盒中，埋深0.3 cm，播种后第5天 (2018年3月25日)间苗至一株，配置营养液与5倍浓度的生物刺激素混合液，播种后于第8天 (2018年3月28日) 和16天 (2018年4月5日)，分别用混合液50 mL进行灌根，培养28天后测定各项指标。

1.3 样品分析方法

分别测定每个处理3株生物量、根长度；生长素 (IAA)、脱落酸 (ABA) 的测定采用HPLC测定内源激素法[13]；脯氨酸 (Pro) 含量、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 活性、谷胱甘肽还原酶 (GR) 活性、过氧化氢 (H2O2)、超氧阴离子 ()、Rubisco酶活性的测定采用酶联免疫法，参照靳德明等的报道[14]。超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、过氧化氢酶 (CAT) 活性、丙二醛 (MDA) 含量的测定用李琲琲等[15]的研究方法；叶片净光合速率 (Pn)、气孔导度 (Gs)、胞间CO2浓度(Ci) 和蒸腾速率 (Tr) 采用LI-6400便携式光合测定仪测定。

1.4 数据分析方法

分别采用Office 2016和SAS 8.2软件进行ANOVA方差分析及Duncan差异显著性检验完成；用Excel 2016软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 小肽螯合铁对樱桃萝卜生物量及根长的影响

生物量和根长分别反映了樱桃萝卜的营养生长状况及其从基质中吸收养分的能力。与CK0(清水25℃) 处理相比，T-Fe-1(21.0 mg/L小肽螯合铁) 处理的整株生物量差异不显著，T-Fe-2、T-Fe-3(32.0、48.0 mg/L小肽螯合铁) 处理显著降低；T-Fe-1与CK(清水30℃) 处理相比，整株生物量显著提高26.0%，与BHG(66.7 mg/L芸苔素内酯) 处理相比差异不显著，而T-Fe-2处理的整株生物量与T-Fe-1和T-Fe-3处理相比显著降低 (表2)。

与CK0处理相比，小肽螯合铁处理显著提高樱桃萝卜的根长；与CK处理相比，T-Fe-1处理根长显著提高35.8%，T-Fe-1处理与BHG处理差异不显著 (表2)。高温下T-Fe-1处理的整株生物量和根长与CK相比均显著提高，说明其添加对高温下樱桃萝卜生长有一定的促进作用。

表2 不同处理的樱桃萝卜整株生物量及根长Table 2 Biomass and root length of cherry radish under different treatments

2.2 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片内源激素及脯氨酸含量的影响

2.2.1 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片内源激素含量的影响图2显示，内源激素ABA和IAA在植物适应逆境的生理过程中起重要作用。与CK0处理相比，T-Fe-1、T-Fe-2处理的IAA含量均显著提高。而TFe-1、T-Fe-2、T-Fe-3处理较CK处理分别显著提高了144%、65.9%、26.1%，说明小肽螯合铁对樱桃萝卜的生长发育起到较好的促进效果。与CK0处理相比，T-Fe处理的樱桃萝卜体内ABA含量差异不显著；与CK处理相比，T-Fe处理的ABA含量显著降低。

图 2 不同处理樱桃萝卜叶片生长素和脱落酸含量Fig. 2 IAA and ABA content in cherry radish leaves in each treatment

2.2.2 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片脯氨酸含量的影响正常生长条件下作物渗透调节物质Pro含量通常较低，而在胁迫条件下表现为上升。T-Fe处理的樱桃萝卜叶片Pro含量与CK0、CK相比均显著上升，与CK处理相比，T-Fe-1处理的Pro含量显著提高229.9%(图3)，说明高温胁迫下添加适宜浓度的小肽螯合铁对樱桃萝卜渗透调节系统均具有显著的改善效果且效果优于芸苔素内酯处理。

2.3 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片抗氧化系统及膜脂过氧化程度的影响

2.3.1 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片抗氧化酶活性的影响表3表明，与CK处理相比，T-Fe-1处理的SOD活性无显著差异，但随着小肽螯合铁浓度增加，对SOD活性的促进作用逐渐加强。T-Fe-1处理CAT活性与CK差异不显著，但较BHG处理显著提高262%。高温处理下APX活性相比CK0均显著提高 (表3)，与CK处理相比，T-Fe-1处理的APX活性显著提高21.7%。与CK0、CK相比，高浓度的TFe处理的GR活性显著提高 (表3)。说明高温胁迫

下，添加小肽螯合铁处理可显著提高APX、GR活性进而提高樱桃萝卜的抗逆性。

图 3 不同处理樱桃萝卜叶片脯氨酸含量Fig. 3 Proline content in cherry radish leavesin each treatment

2.3.2 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片膜脂过氧化程度的影响高温胁迫下，细胞膜上不饱和脂肪酸在活性氧自由基如和H2O2的毒害作用下易发生过氧化，生成MDA，与酶蛋白结合并发生链式反应，使酶蛋白失活，此过程称为膜脂过氧化[16]，而MDA是膜脂过氧化的标志性物质，其含量反映细胞膜的膜脂过氧化程度以及细胞膜受损程度。与CK相比，TFe-1处理的MDA、H2O2含量和活性无显著变化，而T-Fe-2处理的含量均显著降低 (表4)，说明适宜浓度的T-Fe处理对樱桃萝卜细胞膜有保护作用。

2.4 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片光合特性及其调节系统的影响

2.4.1 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片光合特性的影响

表5表明，高温胁迫严重影响了樱桃萝卜叶片的净光合速率，与CK0处理相比，T-Fe-3处理樱桃萝卜的净光合速率 (Pn) 无显著差异，其它各处理均显著降低。T-Fe-3处理樱桃萝卜叶片的净光合速率较CK处理显著提高31.5%。说明在本试验条件下，48.0 mg/L小肽螯合铁有利于提高樱桃萝卜的耐高温胁迫能力，进而保证了植株叶片的净光合速率保持在正常水平。

表3 不同处理的樱桃萝卜叶片抗氧化酶活性Table 3 Antioxidase activity of cherry radish leaves with different treatments

表4 不同处理的樱桃萝卜叶片丙二醛、过氧化氢含量和超氧阴离子活性Table 4 MDA, H2O2 content and O2- activity of cherry radish leaves with different treatments

表5 不同处理的樱桃萝卜叶片光合特性Table 5 Photosynthetic characteristic of cherry radish leaves with different treatments

蒸腾速率 (Tr) 在一定程度上能够反映作物调节水分运动的水平以及适应逆境的能力[17]。与CK0相比，高温胁迫下添加各生物刺激素处理的樱桃萝卜Tr显著提高；与CK相比，小肽螯合铁处理的樱桃萝卜Tr显著降低18.3%～55.2%(表5)，而芸苔素内酯处理显著提高，添加小肽螯合铁可降低樱桃萝卜Tr，从而避免大量水分散失来抵御高温胁迫。与CK0处理相比，高温胁迫下，CK、BHG及T-Fe-1处理的气孔导度 (Gs) 与胞间二氧化碳浓度 (Ci) 均提高；与CK相比，T-Fe处理的Gs与Ci均显著降低。其中T-Fe-1处理的Gs和Ci分别显著降低46.8%和11.3%。说明高温胁迫下，叶片可通过迫使部分气孔关闭进而减少胞间二氧化碳浓度及减少水分散失。2.4.2 小肽螯合铁对樱桃萝卜叶片1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶 (Rubisco) 的影响叶片Rubisco酶在光合碳同化过程中起关键作用，参与光合作用和光呼吸作用过程并调节两者之间的关系，其活性可以反映光合作用暗反应的效率[18]。与CK处理相比，小肽螯合铁处理差异均不显著 (图4)，但T-Fe-3处理与BHG处理相比显著降低，这可能是由于高浓度的小肽螯合铁降低了樱桃萝卜胞间二氧化碳浓度，使Rubisco酶与二氧化碳的亲和力降低进而影响酶活性导致的。

3 讨论

图 4 不同处理樱桃萝卜叶片的Rubisco酶活性Fig. 4 Rubisco activity of cherry radish leaves with different treatments

生长素IAA是作物体内一种重要的内源激素，参与生长发育的各个过程，通过测定生长素的含量可推测作物生长态势[19]。脱落酸是一种典型的胁迫激素，前人研究认为高温胁迫时作物体内脱落酸积累有利于诱导作物耐热性的提高[20]。王日明等[21]研究表明，高温胁迫下维持较高的IAA含量有助于降低自由水的含量，延缓叶片的枯黄衰老和维持细胞膜的稳定性，从而提高作物耐高温能力。本试验结果表明，高温下添加小肽螯合铁处理的IAA含量与30℃对照相比显著增加，这与王日明等的研究结果一致，说明添加小肽螯合铁能提高樱桃萝卜在高温胁迫下的长势。而本试验中小肽螯合铁处理的ABA含量与30℃对照相比显著降低，可能是由于高温胁迫造成作物体内ABA累积，因此30℃对照处理的ABA含量较高，但作物体内ABA过多会抑制细胞分裂与伸长，通过生物量分析，T-Fe处理的ABA 含量对细胞生长发育无抑制作用，反而抵御高温胁迫对樱桃萝卜的伤害，是较适合高温下作物生长的含量水平。

高温胁迫诱导植物活性氧爆发导致生物膜降解，影响植物正常生长发育，作物可通过抗坏血酸—谷胱甘肽循环及谷胱甘肽过氧化物酶循环来缓解胁迫。其中，SOD、CAT和 APX是植物体内酶促防御系统的重要保护酶，它们能有效分解体内活性氧自由基，从而使生物体免受伤害[22]。本试验结果表明，T-Fe-1处理的GR、APX活性与30℃对照相比均显著提高。GR可直接促进还原型辅酶II及谷胱甘肽的生成，从而促进谷胱甘肽过氧化物酶循环，缓解了H2O2的毒害；APX活性的提高可直接促进单脱氢抗坏血酸 (MDHA) 氧化生成抗坏血酸 (AsA)，能够维持AsA-GSH循环快速有效进行，保证了GSH和AsA的再生，从而有效抑制H2O2的增加[15]，抵御高温胁迫。MDA、、H2O2作为衡量膜脂过氧化程度的关键指标，其含量的减少也证实了抗氧化系统在清除活性氧抵御高温胁迫过程中的关键作用。

光合作用是一切生物直接或间接的能量来源，是植物进行物质转换和能量代谢的关键[23]，有研究表明多数植物在短时间高温胁迫下，光合作用就会受到明显抑制[24]。本试验结果表明，在高温胁迫下，与非胁迫CK0处理相比，各处理Pn均显著降低，表明高温对樱桃萝卜的光合作用产生了明显的抑制；TFe-1处理的Pn与CK处理差异不显著，Gs和Ci显著降低，T-Fe-3处理的Pn较CK处理显著提高，而T-Fe-1处理的整株生物量和根长显著高于T-Fe-3处理。童淑媛等[25]研究表明，保持绿色虽然可提高光的俘获，但它并不总是与干物质和谷物产量增加有关。Thomas等[26]描述了4种类型的保持绿色，其中有一种定义为装饰性的持绿，其具有叶片保持色素沉淀的特点，但光合作用下降。因此，造成T-Fe-1处理Pn降低而整株生物量提高的原因可能是光的俘获低而利用率高。与CK0处理相比，高温胁迫下Tr升高可降低叶片温度，而T-Fe-1处理较CK处理Tr降低又可减少叶片失水，维持樱桃萝卜在高温下正常生长。Pro作为渗透调节系统的重要物质，能够通过促进蛋白质的水合作用使蛋白质胶体亲水面积增大，降低细胞水势来提高作物的适应性与抗逆性[27]，对氧化还原电势的变动起到缓冲作用[4]。本研究中，高温胁迫下Gs的降低导致了呼吸作用减弱，进而Ci降低引起细胞内渗透调节系统的变化，为维持细胞体系的平衡，渗透调节物质Pro迅速合成，保障了细胞生命活动正常进行，这可能是高温胁迫下Rubisco酶活性无显著变化的原因。

本试验条件下，小肽螯合铁可提高内源激素含量和活性氧清除系统相关酶活性，及提高作物对高温胁迫的适应性，降低作物损伤，抗逆促生效果显著，具有较强的应用价值，与传统肥料配合可制备抗逆增值型肥料，市场潜力大。然而受到短期培养试验局限性的影响，仍需针对不同地区及作物特性通过田间定位试验验证其效果，同时其抗逆生理生化及分子机制仍需深入探究。