FXR激动剂奥贝胆酸抑制吉非替尼所致的肺纤维化机制的研究

庞 昶，林树无

肺癌发病率逐年上升，已经成为全世界范围内发病率以及病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌占了80%～90%[1]。随着近年来靶向治疗的进展，吉非替尼疗效明显优于常规化疗[2]，但仍有发生严重的药物相关性肺纤维化的风险。肺纤维化进行性加重，呼吸困难是其最常见和最突出的临床症状，其5年生存率为30%～50%[3]。

目前，第一种法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR) 靶向药物奥贝胆酸(obeticholicacid，OCA)已被宣称有效治疗肝纤维化[4]。转化生长因子- β1(transforming growth factor- β1，TGF- β1)是肺纤维化形成的关键因子[5]。α- 平滑肌肌动蛋白(α- smooth muscle actin，α- SMA)参与了肌成纤维细胞的转化及心肌纤维化的发生[6]。Smad 蛋白家族的Smad2/3、Smad7是TGF- β1特异的细胞内信号转导分子[7]。奥贝胆酸减少肝脏纤维化与降低α- SMA、TGF- β1蛋白等纤维化指标密切相关[8]，就是说奥贝胆酸可以下调α- SMA、TGF- β1等肺纤维化指标，或许是奥贝胆酸可能治疗肺间质纤维化的一个机制。该研究应用细胞组和动物组实验检测TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表达水平，初步探讨奥贝胆酸抑制肺纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞组实验材料人肺成纤维细胞HFL1细胞(上海沪震生物科技有限公司)； 1640培养基(美国HyClone生物技术公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus显微镜公司)；高压灭菌锅(日本三洋公司MLS- 3750)；无菌操作台(SW-CJ-1F型，苏州安泰空气技术有限公司)；吉非替尼(生产批号：H20090759，英国Tocris Bioscie公司，200 mg/kg灌胃)；奥贝胆酸(连云港腾发生物科技有限公司，美国Intercept公司生物制药有限公司生产，5 mg/kg 灌胃)；博来霉素(生产批号：H20051232，上海伟进生物科技有限公司，5 mg/kg向气管内注入建模)；小型高速离心机(德国Eppendorf AG 22331 Hamburg)；TGF- β1 ELISA试剂盒、α- SMA ELISA试剂盒、Smad2/3 ELISA试剂盒、Smad7 ELISA试剂盒(武汉优尔生商贸有限公司)；兔抗鼠Smad2/3一抗、兔抗鼠Smad7一抗、兔抗鼠TGF- β1一抗、兔抗鼠α- SMA一抗、兔抗鼠β- actin一抗、羊抗兔二抗(美国Cell Signaling Technology生物公司)。共设置3个实验组[9]：对照组、吉非替尼组、奥贝胆酸+吉非替尼组。将吉非替尼2.5 μmol/L, 奥贝胆酸5 mg/L各3 ml分组与HFL1细胞共培养6 d，采用ELISA方法对TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量进行检测。

1.2 实验动物及分组健康清洁级SD雄性大鼠 60只，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号: SCXK(京)- 2017-0011。实验动物饲养温度(23±1)℃，相对湿度(50±5)%。采用随机数字表法将60只雄性SD大鼠随机分为4个实验组[9]：对照组、博来霉素组、吉非替尼+博来霉素、吉非替尼+博来霉素+奥贝胆酸组。

1.3 模型制备及给药对照组向气管内注入蒸馏水50 μl，余各组实验动物均向气管内注入以蒸馏水稀释的博来霉素(5 mg/kg)溶液50 μl建立肺纤维化模型。注射后迅速沿纵轴旋转，使药物在肺内均匀分布。博来霉素+吉非替尼组2 h后给予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃。吉非替尼+博来霉素+奥贝胆酸组2 h后给予吉非替尼200 mg/kg、2 ml灌胃，4 h后给予奥贝胆酸5 mg/kg、2 ml灌胃治疗。

1.4 动物组实验TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表达的测定实验日期以动物灌胃造模试验当天为实验0 d，实验第1、3、7、14、21天4组每组分别处死3只大鼠，采用ELISA方法对第1、3、7、14、21 d大鼠血浆中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表达进行检测。采用Western blot方法检测21 d大鼠肺组织匀浆中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白表达情况。

1.5 肺组织病理学评价选择实验第1、3、7、14、21天各组大鼠肺组织剪取部分肺叶，做成切片进行HE染色，在100倍光镜下观察肺组织形态变化。

2 结果

2.1 细胞组实验奥贝胆酸对各组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影响与对照组比较，吉非替尼组及奥贝胆酸+吉非替尼组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表达均有所增加，Smad7蛋白的表达逐渐下降，差异有统计学意义(P<0.01)。奥贝胆酸+吉非替尼组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表达各时点均明显低于吉非替尼组，但仍高于对照组，Smad7蛋白的表达显著高于吉非替尼组，但仍低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 细胞组实验各组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量测定

与对照组比较：**P<0.01；与吉非替尼组比较：##P<0.01

2.2 动物组奥贝胆酸对各组大鼠血浆中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影响动物组实验中，与对照组比较，博来霉素组、吉非替尼+博来霉素组、吉非替尼+博来霉素+奥贝胆酸组均随着时间延长，TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表达逐渐升高，各时点均明显高于对照组，Smad7蛋白的表达逐渐下降，各时点均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。吉非替尼+博来霉素+奥贝胆酸组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表达各时点均明显低于博来霉素组及吉非替尼+博来霉素组，但仍高于对照组，Smad7蛋白的表达显著高于博来霉素组及吉非替尼+博来霉素组，但仍低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.3 动物组奥贝胆酸对各组大鼠肺组织匀浆中第21天TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量的影响与对照组比较，博来霉素组、博来霉素+吉非替尼组及博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白的表达均有所增加，Smad7均有所下降，差异有统计学意义(P<0.01)。博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表达低于博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组，但仍高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组21 d Smad7蛋白表达明显高于博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组，但仍低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

表1 各组大鼠血浆中TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白含量比较

与对照组比较：**P<0.01；与博来霉素组比较：##P<0.01；与吉非替尼+博来霉素组比较：▽▽P<0.01

2.4 奥贝胆酸对各组大鼠肺组织病理形态学的影响肺组织病理切片HE染色结果示对照组结构清晰，未见明显形态改变、炎症浸润和纤维化。与对照组大鼠肺组织相比，博来霉素+吉非替尼组大鼠肺水肿，明显的纤维组织增生。博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组早期(1～7 d)病理特征为肺充血、肺水肿及炎性细胞浸润。博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组14 d后，肺泡结构遭到破坏，纤维结缔组织增多，肺泡壁逐渐增厚。博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组21 d后，胶原沉积，肺组织弥漫性肺纤维化。与博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组大鼠肺组织相比，博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组病理学改变有显著改善，肺组织纤维化程度显著减轻。见图 3。

3 讨论

非小细胞肺癌是肺癌中较常见的类型，由于早期无典型症状，故多数患者就诊时已为晚期，错失手术最佳时机，而化疗成为了晚期非小细胞肺癌首选的治疗方式[10]。吉非替尼是一种分子靶向药物，可抑制肿瘤生长，全球因吉非替尼所致的间质性肺炎平均发病率约1%[11]。现有的治疗方法不能有效地缓解病情的发展和使肺纤维化逆转，迫切需要新的治疗药物减缓肺纤维化进展。

图2 动物组中各组21 d TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7蛋白的表达水平

A：对照组；B：博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组；C：博来霉素组；D：博来霉素+吉非替尼组；与对照组比较：**P<0.01；与博来霉素组比较：##P<0.01；与吉非替尼+博来霉素组比较：▽▽P<0.01

图3 各组各时间段大鼠肺组织病理变化HE ×100

A：对照组；B：博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组；C：博来霉素组；D：博来霉素+吉非替尼组

在纤维化进程中，会受到TGF- β1与下游Smad 蛋白家族信号通路的调控[12]。Smad3 促进纤维化的形成，Smad7 却是TGF- β1 信号转导途径的主要抑制性蛋白[13]。已经有多个研究[14]证实单纯用吉非替尼灌胃小鼠不能引起肺组织明显的纤维化改变。博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型目前已较成熟，故使用博莱霉素诱导大鼠肺纤维化后，予吉非替尼及奥贝胆酸进行干预，观察其对纤维化效果的影响，是一种高效、切实可行的办法。本研究选择TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7作为观察指标。结果表明，博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表达均有所增加，Smad7蛋白表达均有所下降，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，肺纤维化程度加重。博来霉素+吉非替尼+奥贝胆酸组与博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组比较TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白表达均降低，Smad7蛋白的表达均升高，可见奥贝胆酸可以拮抗吉非替尼，达到降低肺纤维化的程度。本实验中肺组织病理学镜下观察发现，博来霉素组及博来霉素+吉非替尼组肺泡内可见大量胶原片状，絮状沉积，纤维灶融合。而奥贝胆酸治疗组可见肺泡内胶原沉积显著减少，肺泡破坏减轻，无明显纤维灶融合。可见奥贝胆酸可以抑制吉非替尼诱导的肺纤维化病理过程。综上可见，加入奥贝胆酸干预后TGF- β1、α- SMA及Smad2/3蛋白含量表达均降低，Smad7蛋白表达均升高，同时大鼠肺组织病理纤维化程度降低，证实奥贝胆酸可以通过干预TGF- β1、α- SMA及Smad2/3、Smad7信号对吉非替尼导致的肺纤维化产生保护作用。本实验仅为初步研究，后续还可以通过研究溶血磷脂酸(LPA)、丙二醛(MDA) 、超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化氢酶(CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH) 、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白等肺纤维化相关指标，以进一步求证奥贝胆酸对吉非替尼诱导的肺纤维化的作用。

吉非替尼近年来广泛用于局部晚期与转移性NSCLC的治疗。肺间质纤维化是吉非替尼治疗过程中少见但致命的不良反应。在既往的研究中，显示吉非替尼抗肿瘤同时具有抑制气管上皮细胞表皮生长因子受体的表达功能，影响其受损后的修复，导致免疫反应失控，产生间质性肺炎[15]。寻找合适的抗肺纤维化药物和阻止肺纤维化疾病的策略，己经持续了好几十年，但是理想的治疗手段还没有找到。本实验证实奥贝胆酸能够减弱吉非替尼诱导的肺纤维化程度，为肺纤维化的治疗提供一种新的思路，创造良好的社会价值及医疗价值。