常压低温等离子处理提高花生分离蛋白水合性质的研究

2019-09-11季慧陈野

中国粮油学报 2019年8期

季慧陈野

(临沂大学生命科学学院1，临沂 276000)(天津科技大学食品工程与生物技术学院；教育部食品营养与安全实验室2，天津 300457)

脱脂花生粉是花生提取花生油后的副产品,含有高质量的蛋白质(47～55%)和低剂量的抗营养因子。然而，脱脂花生粉由于其溶解度及其它功能性质较差，主要用作动物饲料，而未得到广泛应用。花生分离蛋白(PPI)蛋白质含量较高(> 85%), 其功能性质中乳化性能、发泡和凝胶特性等，与如大豆蛋白等相比，仍然具有较大差距[1]。溶解度是蛋白质最重要的特性之一，它会影响蛋白质的其他功能特性。改善花生分离蛋白的溶解性能对提高其在食品工业中的应用至关重要。

为了提高花生蛋白的溶解特性，国内外专家对花生蛋白的功能特性进行了一系列的物理和化学改性研究，其中包括酶解、高压、超声波处理、微射流、微波和糖基化处理[2-5]。这些方法确实可以在不同程度地提高了花生蛋白的溶解性能，但容易引起反应产物复杂、热变性和食品安全性问题未被广泛应用。

常压低温等离子体(ACP)是一种全新的、无危害、无热、高技术、前景广阔的高新技术，目前在食品工业中备受关注。ACP被称为非热能电子，因为电能产生的高能电子直接作用于等离子体的电子元件，使得等离子体的处理组分保持在室温[6]。低温等离子改性蛋白的研究是近年来蛋白质改性研究的热点之一。ACP处理使乳清蛋白、小麦粉、玉米醇溶蛋白等的功能特性(蛋白乳化活性、溶解度、泡沫稳定性)发生变化[7-9]。然而，通过ACP技术对花生蛋白粉进行改性，特别是水合性质的研究报道却很少。Sinha[10]报道了等离子体修饰可以在高能离子轰击下蚀刻高分子材料表面，并诱导一些极性自由基。因此，推测低温等离子可以形成或暴露更多亲水性的蛋白质基团，增加与水结合的位点，提高蛋白水合性质。本实验在研究低温等离子对花生分离蛋白粉末的水合性质的影响，以期探索提高蛋白溶解度的机理，为利用花生分离蛋白制备可控药物缓释载体蛋白水凝胶，新型高保水工业材料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

低温花生粕；血清白蛋白；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DBD-50低温等离子体；PQ001核磁共振分析仪；F-4500荧光分光光度计；NicoletiS50傅立叶变换红外光谱仪。

1.3 试验方法

1.3.1 花生分离蛋白的制备

参照Ji 等[11]的方法，提取花生分离蛋白，PPI的蛋白质质量分数为 83.0% (凯氏常数：5.46)。

1.3.2 低温等离子处理样品

将花生分离蛋白粉末过 80 目筛以保证颗粒大小的均匀性。称取1.0 g左右的花生分离蛋白粉均匀平铺于石英反应槽内，固定放电电压到为 70 V，电流保持在(1.0±0.2)A，分别处理1、3、5、7、10 min，处理温度为 25 ℃，得到不同处理时长的花生分离蛋白粉末样品。

1.3.3 溶解度测定

根据Kong等[12]的方法，取1.00 g低温等离子处理后的花生分离蛋白粉溶于100 mL 0.1 mol/LPBS (pH=7)溶液中充分溶解后，在3 000 r /min下离心15 min。取1 mL上清液加入4 ml双缩脲试剂，旋涡充分混合。反应30 min后，在540 nm下测定溶液的吸光度，不添加花生分离蛋白的样品为空白。

1.3.4 凝胶的制备

将低温等离子处理后的花生分离蛋白用含有 0.06 mol/L CaCl2，0.1 mol/L 的 PBS 缓冲液(pH=7.0)充分溶解，将其浓度调至 150 mg/mL 后，分别称取50 g的蛋白液于100 mL烧杯中，用保鲜膜密封，放入90 ℃水浴锅中保温60 min后，立即取出冷水浴后，于4 ℃冰箱中放置 24 h后，进行后续指标测定。

1.3.5 凝胶持水性测定

称取蛋白凝胶样5 g左右，于15 mL干燥并已称重的离心管(记离心管的重量为W0)中，凝胶样品和离心管的总重量为W1。8 000 r/min 离心 15 min，将析出的水倒掉，并使用滤纸吸取残留的水分后，称重并记录此时凝胶样品和离心管的总质量(W2)。凝胶持水能力(WHC)采用以下公式计算：

1.3.6 核磁共振分析

采用低场NMR 弛豫测定凝胶样品的横向弛豫时间 T2，测定条件：质子共振频率为 22.6 MHz，测量温度为 32 ℃。取2花生蛋白凝胶直接放入直径25 mm核磁管中，随后立即放入PQ-001 核磁共振仪中进行分析。采用 Carr-Purcell- Meiboom-Gill(CPMG)脉冲序列进行自旋-自旋弛豫时间 T2、T2峰面积比的测定。参数设定：Tw=2 000 ms; NS=8; NECH=10 000。

1.3.7 表面疏水性(H0)的测定

采用 ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)荧光探针法[13]，用 0.01 mol/L 的磷酸盐缓冲液(pH7.0)配制不同浓度的样品蛋白溶液(0.005%～0.2%)和 8 mmol/L的ANS溶液。取20 μL ANS 溶液加到4 mL蛋白溶液中，混合均匀，迅速测定混合液的荧光强度，激发波长和发射波长分别为 390 nm 和 470 nm，以荧光强度对蛋白质浓度作图，直线斜率即为蛋白质样品的表面疏水性指数(H0)。

1.3.8 傅里叶红外光谱分析

准确称量 0.001 g 花生蛋白样品，加入一定量的KBr至0.15 g，用研钵研磨成均匀粉末，压制成薄片，用傅里叶红外光谱仪做全波段扫描 (4 000 cm-1～400 cm-1) ，扫描次数为32[14]。

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

采用还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法鉴定低温等离子处理前后花生分离蛋白中亚基的变化情况[15]。分离胶和浓缩胶的浓度分别为 12%和 4%，样品中加入 1 mmol/L β-巯基乙醇。电泳后，蛋白胶用考马斯亮蓝 R250 染色。

2 结果与讨论

2.1 水合特性

2.1.1 花生分离蛋白(PPI)溶解度的变化

图1 低温等离子处理对花生分离蛋白溶解度的影响

为了分析PPI的溶解度的变化，将未处理(对照)和ACP处理的PPI的溶解度和pH值绘制在图1中。由图1可以看出，随着ACP处理时间的增加，蛋白的溶解度逐步提高，在处理7 min时，花生分离蛋白的溶解度与未处理时样品相比增加9.74%，处理7 min后略有下降，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0) pH总体不变略有下降。ACP产生的高能粒子的蚀刻作用可以使蛋白比表面积增加，更多的活性位点被暴露，蛋白亲水性增强，PPI的溶解度增加。7 min处理后PPI溶解度下降可能是随着处理时间的持续延长，蛋白部分变性而聚集，蛋白溶解度降低。

2.1.2 PPI凝胶化性能

2.1.2.1 PPI凝胶持水能力(WHC)

WHC是评价蛋白质凝胶中持水能力的重要参数。WHC可以反映凝胶内部结构的粗糙度[16]。低温等离子处理后的PPI凝胶体系的WHC如图2所示。低温等离子处理后，蛋白凝胶持水性随着处理时间的延长而增加，处理3 min时，PPI凝胶的WHC达最高，从20.09%(0 min)增加到22.90%(3 min)，比未处理的样品高出13.99%; 3 min后随ACP处理时间的延长WHC下降。

图2 低温等离子处理对花生蛋白凝胶持水性的影响

2.1.2.2 核磁共振分析

注：从上到下代表处理时间分别为3、1、5、7、10.0 min图3 低温等离子处理对花生蛋白凝胶弛豫时间分布影响

从图3、表1可以看出，花生蛋白凝胶的T2在0.1～2 000 ms的弛豫时间分布上均出现了3 种峰，分别用T2b、T21和T22表示，其水分分布与豆腐相似[17]。T22表示花生蛋白凝胶网络以外可以自由移动的水，受蛋白凝胶网络的影响最小，称为自由水[18]。 T21(中间水分)代表分布在蛋白凝胶网络表面的水分子，受蛋白凝胶的氢键、疏水相互作用和静电相互作用的影响，T21峰面积比例与WHC呈正相关。 T2b表示与蛋白质等大分子表面的极性基团以氢键相结合的单层水，以及位于大分子固有结构的质子，与WHC相关性最小[19]。

表1 低温等离子处理时间对不同峰面积比例的影响

注：同一列数据标注不同字母表示数据间有显著性差异(P<0.05)。

随着ACP处理时间的延长，T21的峰面积所占比例逐渐增大，在ACP处理3 min时，T21的峰面积比例达最大，从80.4%(0 min)上升到84.9%(3 min), 峰面积比例增加了5.6%。(图3、表1)。结果显示ACP处理可以明显增加蛋白质凝胶网络表面的水基团数量。3 min后，T21的峰面积略有下降，其趋势与WHC 变化趋势一致。

2.2 花生分离蛋白表面疏水性的影响(H0)

疏水力被认为是维持蛋白质高级结构的主要作用力，在三级结构的形成和稳定中起着重要作用[20]。低温等离子处理可能引起花生分离蛋白表面疏水区域分布的变化。以ANS为荧光探针，对花生蛋白表面疏水性的变化进行表征。从图4中可以看出, 在等离子处理前3 min内，花生分离蛋白表面疏水性指数(H0)显著降低(P<0.05)，H0从 9 978 ±328.4(0 min)下降到4 397±288.4(3 min)，3 min后H0值明显增加，但在处理7 min内，H0均低于未处理样品。

图4 低温等离子处理对花生分离蛋白表面疏水性指数影响

等离子处理3 min内，H0逐渐下降，说明花生分离蛋白的亲水性增强，疏水性相互作用减弱，大量的水被结合到蛋白表面，该结果与花生分离蛋白的凝胶持水性(WHC)变化趋势一致。处理3 min后表面疏水性的增加可能是由于高能粒子轰击后，蛋白分子结构展开，表面分子间疏水性增加。

2.3 花生分离蛋白的二级结构

选取红外光谱中的酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)进行详细研究，用Omnic软件用对蛋白质各二级结构进行定量分析。对应于二级结构的谱带如下：1 650～1 670 cm-1对应于α-螺旋，1 610～1 640 cm-1对应于β-折叠，1 660～1 700 cm-1对应于β-转角，1 640～1 650 cm-1对应于无规则卷曲。每个二级结构组分的百分比通过相应峰的面积来计算[21]。蛋白质各二级结构进行定量分析结果如表2。

表2 低温等离子处理时间对花生蛋白二级结构的影响

从表2可以看出, 在等离子处理的前3 min内，α-螺旋和β-转角所占比例呈上升趋势，β-折叠呈明显的下降趋势,从32.34% (0 min)下降至24.00% (3 min)。二级结构的变化与Dong等[9]和Ji等[11]报道一致。结果表明,β-折叠变成α-螺旋和β-转角, 蛋白分子间氢键增强，可能是由于低温等离子处理产生的高能粒子(氧化剂)使花生分离蛋白的二级结构变紧密。Safonov等[22]的研究表明，花生分离蛋白较稳定的二级结构的形成可能与臭氧有关。处理3 min后, β-折叠和无规卷曲比例的增加,α-螺旋和β-转角的下降，预示着花生分离蛋白的结构由紧密变松散。

图5 等离子处理后花生分离蛋白的SDS-PAGE图

2.4 SDS-PAGE结果

由图5可知，花生蛋白亚基的电泳图谱包含5个主要类别：伴花生球蛋白(>50 ku)、酸性花生球蛋白(38～49.9 ku)、中分子量蛋白质(23～37.9ku)、碱性花生球蛋白(18～22.9 ku)、低分子量的花生球蛋白(14～17.9 ku)。与未处理的花生分离蛋白相比，等离子处理并没有引起蛋白质电泳图谱的重大变化，表明低温等离子处理花生分离蛋白粉末并没有改变花生蛋白的一级结构。