南极磷虾磷脂的分离纯化及其对核桃油的氧化稳定性的影响

周 莉 杨 富

(中南民族大学药学院，武汉 430074)

核桃油是从核桃仁(含油率为58.3%～74.7%)提取的植物油，油色黄亮，具有水果香味。核桃油营养丰富，多不饱和脂肪酸含量高(占总脂的78%)[1]，具有降血脂、预防冠心病、预防动脉粥样硬化、提高学习记忆力和视网膜反射能力、预防老年痴呆症和癌症等作用[2-4]。 因此，近年来核桃油作为功能性油脂越来越受到消费者的青睐。但是，核桃油中高含量的多不饱和脂肪酸非常容易被氧化，已成为影响其营养品质和货架期的重要问题。为了延长保质期，目前食品工业主要使用人工合成的抗氧化剂如2,6-二丁基对甲酚 (BHT)、叔丁基对羟基茴香醚 (BHA)、没食子酸丙酯 (PG) 和特丁基对苯二酚 (TBHQ) 等。研究表明这些抗氧化剂能提高核桃油的氧化稳定性，但是这些抗氧化剂都具有一定的潜在毒性，其安全性一直是公众担心的问题[5,6]。因此，开发和利用天然抗氧化剂已成为当今食品科技发展的方向，也是食品工业关注的问题。

南极磷虾油中不仅含有人体所必须的脂肪酸，而且含有丰富的维生素E、维生素A、虾青素、磷脂质、类黄酮等功能因子[7]。此外，南极磷虾油中富含磷脂。磷脂是天然的抗氧化剂，具有较好地抗氧化活性[8-9]。因此，将南极磷虾磷脂添加到核桃油中，研究南极磷虾磷脂对核桃油氧化稳定性的影响具有重要意义。

本研究采用薄层色谱法将南极磷虾磷脂的各个组分进行分离纯化，然后将南极磷虾磷脂各组分按照一定的比例添加到核桃油中，考察核桃油在贮藏过程的氧化稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃仁产自云南大姚县；核桃油自核桃仁提取精炼而得；南极磷虾肉由辽宁省大连市海洋渔业集团提供，置于-20 ℃冰箱保存；三氯甲烷、甲醇、无水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、氢氧化钾、碘化钾、淀粉、硫代硫酸钠、次氯酸钠、酚酞、重铬酸钾、柱层析硅胶均为国产分析纯试剂；卵磷脂和脑磷脂。

1.2 仪器与设备

Heidolph Laborota 4000真空旋转蒸发仪； BL-220H分析天平；HH-4数显恒温水浴锅；电子天平 AEL-160；碘量瓶、移液管、滴定管。

1.3 方法

1.3.1 高压溶剂萃取法提取南极磷虾油

先将南极磷虾肉置于冷冻干燥仪中干燥，取1 g经冷冻干燥后的样品与1 g沙子混合均匀后置于10 mL的萃取池中。使用沙子的目的是为了加速两相之间的溶质交换，并填充萃取池空隙以减少溶剂体积。萃取溶剂∶三氯甲烷∶甲醇 (88∶12)；萃取温度：120 ℃；萃取时间：5 min；萃取压力，10.34 MPa。然后，用旋转蒸发仪将萃取溶液中的有机溶剂蒸发去除，接着置于氮气下吹干得到的萃取物，最后将其置于-18 ℃的冰箱贮存[10,11]。

1.3.2 南极磷虾油液相色谱分析

色谱柱： thermo hypersil silica (150 mm×4.6 mm，3 μm)；流动相A为正己烷∶异丙醇 (3∶2)；流动相B为水；流速为0.5 mL/min；柱温室温；柱温为25 ℃；雾化氮气压力为310 kPa。检测器：蒸汽光散射(ELSD)；进样体积为 20 μL。线性梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

1.3.3 南极磷虾磷脂各组分的分离纯化

采用薄层色谱法对南极磷虾磷脂各组分进行分离纯化，采用硅胶60F254铝箔板，采用三氯甲烷-甲醇-25%氨水(65∶25∶4)作为层析液，分析洗脱组分中的磷脂种类。然后，将薄层层析板置于室温中5 min，待干燥后，用含20%乙醇的磷钼酸喷涂，150 ℃加热。显色部分与标准样品(卵磷脂和脑磷脂)对比，之后将对应的磷脂组分的硅胶刮取，用三氯甲烷萃取，并采用真空旋转蒸发仪去除溶剂，得到南极磷虾脑磷脂和卵磷脂[12]。

1.3.4 抗氧化效果研究

采用Schaal烘箱法，在30 g核桃油中加入不同质量比例的南极磷虾油、南极磷虾磷脂和赖氨酸，在温度为(60±1)℃的恒温烘箱中放置24 d，使其加速氧化，以过氧化值和酸价为指标来评价添加剂对核桃油的抗氧化效果[13]。

1.3.5 核桃油过氧化值的测定[14]

准确称取核桃油2 g于碘量瓶中，冷却至室温后，加入30 mL冰醋酸和氯仿的混合液，振荡使其混合均匀，再加入2 mL KI饱和溶液，振荡30 s后置于暗处静置5 min，加入100 mL蒸馏水，振荡，用Na2S2O3滴定至溶液呈浅黄色，加入3滴淀粉指示剂，继续滴定至无色，记录Na2S2O3的体积，计算得出样品油的POV值。

过氧化值=1 000×V×C/2m

其中，V表示滴定消耗的硫代硫酸钠溶液体积(ml)；C表示硫代硫酸钠溶液浓度(mol/L)；m表示称取的核桃油的质量(kg)

1.3.6 核桃油酸价的测定[15]

分别称取含不同浓度南极磷虾油的核桃油样品5 g，精确到0.01 g，加入到锥形瓶中，分别加入50 mL乙醇溶液，滴入1-2滴酚酞指示液，摇匀后用标定好的氢氧化钾溶液进行滴定至溶液变色时停止滴定，并且保持溶液15 s内不褪色，即为终点。记录氢氧化钾溶液消耗的体积，同时做三组平行实验。测量时间间隔至少为24 h。

酸价=V×C×56.1/m

式中：V为滴定消耗的KOH溶液体积(mL)；C为KOH溶液浓度(mol/L)；m为称取的核桃油的质量(g)；56.1为KOH的摩尔质量(mol/g)。

2 结果分析

2.1 南极磷虾油的液相色谱图

建立基于蒸汽光散射检测器(ELSD)的高效液相色谱法 (HPLC) 对南极磷虾油的磷脂各组分进行分离鉴定。图1表示的是标准样品(脑磷脂和卵磷脂)的液相色谱图。通过对比可知，南极磷虾油含有两种磷脂组分，即脑磷脂和卵磷脂，保留时间分别在9.4 min和18.7 min，本方法能有效分离鉴定南极磷虾磷脂，且分离度较好(图1)。结果与其他学者相似[16,17]。

图1 标准样品的液相色谱图

图2 南极磷虾油的液相色谱图

2.2 南极磷虾油对核桃油氧化稳定性的影响

在核桃油中分别加入质量比为0.25%、1%和1.5%的南极磷虾油，并将这些样品置于(60±1)℃ 的恒温条件下加速氧化24 d，取样分析其过氧化值和酸值。由图3可见，对照组的过氧化值增长很快，放置24 d，过氧化值迅速上升到82.3 mmol/kg，而南极磷虾油的核桃油样品的过氧化值的增加明显减少，而且随着添加量的增加，过氧化值增加越慢。当南极磷虾油的添加量为1.5%时，过氧化值仅为48.9 mmol/kg。值得注意的是，当添加量分别为0.25%和1%时，核桃油过氧化值的增加没有显著性差异。说明0.25%的南极磷虾油添加量就能起到较好地抑制核桃油过氧化值增加的效果。

图3 不同质量比的南极磷虾油添加量对核桃油过氧化值的影响

图4 不同质量比的南极磷虾油添加量对核桃油酸价的影响

由图4可见，对照组的酸价增长很快，在(60±1)℃恒温条件下，放置24 d，酸价迅速上升到3.06 mg(KOH)/g，而添加了南极磷虾油的核桃油的酸价仅为1.89～2.15 mg(KOH)/g。说明南极磷虾油对核桃油酸价增长具有较好的抑制性。当南极磷虾油的添加量为0.25%时，核桃油酸价增长的抑制效果和添加量为1%没有显著性差异，两者变化相近，酸价分别为2.15 mg(KOH)/g和2.08 mg(KOH)/g。

综上所述，当南极磷虾油的最低添加量为0.25%时，对核桃油的过氧化值和酸价的增长均有较好的抑制效果，因此，南极磷虾油对核桃油具有较好地抗氧化活性。

2.3 南极磷虾磷脂与增效剂复配对核桃油氧化稳定性的影响

有研究表明，磷脂的抗氧化性能是由于其胺基基团或氨基酸残基与磷脂的氧化产物发生了羰基反应，生成了抗氧化产物[18-20]。为此，我们进一步分离纯化出了南极磷虾各磷脂组分(脑磷脂和卵磷脂)，然后考察各种磷脂组分与赖氨酸在核桃油中的抗氧化协同效果。

图5 不同质量比的南极磷虾磷脂组分对核桃油过氧化值的影响

图6 不同质量比的南极磷虾磷脂组分对核桃油抗氧化作用的酸价的影响

由图5和图6可知，与空白对照相比，在核桃油中添加了南极磷虾卵磷脂或脑磷脂都能抑制过氧化值和酸价的增加。抗氧化效果从大到小依次是，0.08%脑磷脂+0.02%赖氨酸、0.1%脑磷脂、0.1%卵磷脂和0.08%卵磷脂+0.02% 赖氨酸。结果表明，南极磷虾脑磷脂体现出显著的抗氧化能力，尤其是与微量赖氨酸的复配增加了抗氧化效果。可能是因为脑磷脂的胺基基团与氧化产物以及氧化产物与赖氨酸发生羰氨反应共同生成了抗氧化产物从而提高核桃油的氧化稳定性[21-24]。此外，南极磷虾卵磷脂虽然不含胺基基团，但也表现出了抗氧化性能。表明南极磷虾卵磷脂所含的高度不饱和脂肪酸链非常容易被氧化[25,26]，产生的氧化产物可能会与核桃油中自身含有的氨基酸残基或者赖氨酸发生羰氨反应生成抗氧化产物，增强核桃油稳定性。

3 结论

本文研究南极磷虾油、南极磷虾脑磷脂、卵磷脂及赖氨酸的添加对核桃油的氧化稳定性的影响。首先，采用蒸汽光散射检测器 (ELSD) 的高效液相色谱法 (HPLC) 对南极磷虾油的磷脂各组分进行分离鉴定，分析出南极磷虾油中主要含有卵磷脂和脑磷脂，且分离效果较好。之后，采用了薄层色谱法对南极磷虾磷脂各组分进行分离纯化，得到了南极磷虾卵磷脂和脑磷脂组分。最后，考察了不同质量比例的南极磷虾油的对核桃油的抗氧化效果，结果表明南极磷虾油能提高核桃油的氧化稳定性，而且0.25%的南极磷虾油添加量就能较好地抑制核桃油过氧化值和酸价的增加，随着浓度的增加，抗氧化性能增加。此外，分析了0.08%脑磷脂+0.02%赖氨酸、0.1%脑磷脂、0.1%卵磷脂和0.08%卵磷脂+0.02%赖氨酸的抗氧化效果，结果表明南极磷虾磷脂各组分都具有抗氧化能力，都能有效抑制过氧化值和酸价的升高，提高核桃油的氧化稳定性，尤其是脑磷脂组分及脑磷脂与赖氨酸的复配对核桃油氧化稳定性的提高具有显著的效果。