浸泡和发芽对杂豆酚类物质及其抗氧化性的影响

刘婷婷 包佳微 李嘉欣 阮长青

(黑龙江八一农垦大学食品学院；黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室，大庆 163319)

2016年粮农组织将豆类的定义限定于仅从干粮中收获的作物[1]。豆类不仅富含蛋白质、糖类和纤维等必需营养素，也含有酚类化合物和其他次生代谢产物。酚类是具有至少一个芳香环且环上至少连接一个或多个羟基的化合物，以游离，组合或结合的形式存在[2]。酚类有助于植物性食物整体的抗氧化活性，是很好的营养保健的功能成分[3]。大部分种皮带有颜色的豆类提取物中总酚含量相对较高，它们比大多数普通的水果、蔬菜和谷类食品具有更高的抗氧化效果[4]。

浸泡处理是发芽的必要前处理过程，适当的浸泡可以使生豆质地变软，便于加工并缩短处理时间，另外浸泡还可以减少蛋白酶抑制剂、植酸、胃胀气因子等抗营养成分的含量，同时浸泡过程中也会伴随一些酚类物质的变化[5-7]。豆类在适宜的温度环境和水分条件下能够萌发出胚芽，新生的胚芽可以增加生物活性化合物和减少抗营养成分，并且提高了蛋白质、淀粉等营养素的适口性、可消化性和可用性[8-9]。大豆在发芽过程中异黄酮的变化为近几年的研究热点，发芽可以使大豆中的异黄酮含量显著增加[10-11]。Wu等[12]发现发芽大大增加了鹰嘴豆中的异黄酮含量和多样性，特别是异黄酮含量增加了100多倍。由此可见发芽可以使豆类中的异黄酮的质和量都发生变化。但目前缺少有色豆类发芽的研究，因此研究浸泡和发芽对有色豆类中酚类物质的影响，对于进一步选择适宜的加工方式、保留酚类物质具有一定的理论及实际意义。

本实验选取黑龙江省6种主栽杂豆(黑大豆、黑小豆、红小豆、绿豆、紫花芸豆、红芸豆)为研究对象，研究浸泡和发芽过程中豆类总酚、总黄酮、总花青素和总缩合单宁的变化规律，通过抗氧化能力的测定，探究浸泡和发芽对豆类抗氧化活性的影响，分析酚类物质与抗氧化活性的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑大豆(青仁黑豆)、黑小豆(小黑芸豆)、红小豆、绿豆(明绿)、红芸豆(英国红)、紫花芸豆：产地均为黑龙江省。

没食子酸标准品、儿茶素标准品、矢车菊素-3-葡萄苷标准品、福林酚试剂、DPPH、总抗氧化试剂盒；无水乙醇、无水碳酸钠、亚硝酸钠、三氯化铝、氢氧化钠、水杨酸、30%过氧化氢、硫酸亚铁均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DYJ-S6365小熊双层豆芽机；KQ-250E超声波清洗器；723N可见分光光度计。

1.3 杂豆的浸泡处理

杂豆的浸泡时间通过浸泡含水率曲线确定。根据Xu[13]的方法稍作修改，称取20 g杂豆用清水冲洗，去除杂质灰尘，以豆水比为1 ∶3的比例用蒸馏水浸泡杂豆，在浸泡初始0～6 h的时间内每小时测量一次杂豆的含水率，然后从6～12 h每2 h测量一次，之后从12～30 h每6 h测量一次。每次捞出的杂豆用纸巾吸干表面多余的水分，称重并放回到浸泡水中，并按照如下公式计算浸泡后的含水率。

式中：X为含水率；m1为干豆的质量/g；m2为浸泡后杂豆的质量/g；MC为干豆的含水量/%。

以杂豆含水率为纵坐标(y值)，时间为横坐标(x值)，绘制曲线。将饱和含水率曲线开始进入平缓的时间确定为杂豆最终的浸泡时间。

1.4 杂豆的发芽处理

将浸泡后的杂豆捞出后置于豆芽机内进行避光发芽，豆芽机每1 h洒水一次，每隔12 h换水一次。每天进行取样，共发芽5 d。

1.5 提取物的制备

将上述浸泡、发芽后的杂豆置于40 ℃烘箱内烘干。将得到的干燥样品磨碎后过60目筛。粉碎后的豆粉用自封袋密封，豆粉置于4 ℃干燥条件下进行保存。

精确称取1 g杂豆粉，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL 80%乙醇溶液，封住瓶口。于超声清洗仪中超声30 min(温度25 ℃、功率250 W)，提取液于3 000 r/min离心10 min，收集上清液。将沉淀按上述过程二次提取后合并上清液，于-20 ℃中保存待测。每个样品平行3次提取。

1.6 指标测定

1.6.1 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量，根据Singleton[14]和Xu[15]的方法稍作修改，取400 μL提取溶液，加3 mL去离子水、250 μL福林酚溶液，静置5 min后加入750 μL 7%碳酸钠和950 μL去离子水，旋涡混匀，避光反应1 h,于765 nm处测定吸光度值。以没食子酸(GAE)为标准品制作标准曲线，结果以没食子酸当量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.2 总黄酮含量的测定

参照Zhishen[16]和Michalska[17]的方法测定总黄酮含量。取2 mL提取溶液，加入1.25 mL去离子水和75 μL 5%亚硝酸钠，静置5 min后加150 μL 10%三氯化铝，静置反应6 min，加入500 μL 1mol/L氢氧化钠和3 mL去离子水漩涡混匀，于495 nm处测定吸光度。以儿茶素(CAE)为标准品制作标准曲线，结果以儿茶素当量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.3 总花青素的含量

根据Lee[18]和Shao[19]的方法进行改进，取500 μL矢车菊素-3-葡萄苷标准液或者提取液，分别加入2 mL 0.025 mol/L 氯化钾盐酸缓冲溶液(pH 1.0)和2 mL 0.4 mol/L醋酸钠溶液(pH4.5)。充分混合后静置20 min，分别在510 nm和700 nm波长处测定吸光度值。结果以矢车菊素-3-葡萄苷当量表示(mg/g样品)，并且花青素含量计算公式如下：

式中：C为花青素含量；A为(A510 nm-A700 nm) pH1.0-(A510 nm-A700 nm) pH4.5;MW为花青素分子量(449.2)；DF为稀释因子；ε为摩尔光吸收值(26 900)。

1.6.4 总缩合单宁的含量

缩合单宁含量根据Broadhurst[20]的方法进行测定，将500 μL提取液与2 mL 4%香草醛甲醇溶液和1 mL浓盐酸充分混合，混合物静置15 min后在500 nm处测定其吸光度值。以儿茶素(CAE)为标准品制作标准曲线，结果以儿茶素当量表示(mg/g干豆粉)。

1.6.5 总抗氧化能力(T-AOC)测定

使用南京建成生物工程研究所的总抗氧化能力试剂盒测定提取液的总抗氧化能力(T-AOC)，计算公式如下：

式中：T-AOC为总抗氧化能力/U/mg；OD为测定组吸光度值；OD′为对照组吸光度值；TRF为反应液总量；SV为取样量；DR为样本测定前稀释倍数；EC为提取液浓度。

1.7 数据统计分析

每个样品均平行提取3次进行测定，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，浸泡和发芽前后的杂豆样品之间的差异采用单因素方差分析进行显著性分析，P<0.05为差异性显著，采用Person相关分析对样品的总酚含量、总黄酮、花青素、缩合单宁和总抗氧化能力进行相关性分析。使用Origin 2017软件作图。

2 结果与分析

2.1 杂豆浸泡时间的确定

由于干豆质地坚硬，浸泡处理可以软化杂豆，使其易于进一步加工处理，且杂豆萌发前需进行浸泡，然而浸泡时间过长会使部分酚类物质流失，因此杂豆浸泡时间的确定尤为重要。参照Xu[21]的方法，杂豆在浸泡过程中的含水率达到饱和即可(含水率曲线开始进入平缓)。由图1可确定黑大豆、黑小豆、红小豆、绿豆、红芸豆、紫花芸豆的浸泡时间分别为18、10、24、18、12、12 h，6种杂豆在此浸泡条件下进行发芽处理。

图1 浸泡过程中的杂豆的饱和吸水率曲线

2.2 浸泡和发芽对杂豆总酚的影响

由表1可知，浸泡和发芽对6种杂豆中总酚含量均有显著影响。浸泡过程中一些水溶性酚类物质会溶出，造成浸泡过后的黑大豆、黑小豆、红小豆、红芸豆、紫花芸豆的总酚含量比干豆减少了15.13%～40.37%，而绿豆的总酚含量增加了23.17%，原因可能是绿豆的主要结合酚酸为咖啡酸，浸泡过程会破坏咖啡酸与其他物质如蛋白质、多糖的稳定结构，从而促使咖啡酸游离出来[22]。但咖啡酸微溶于水，却易溶于热水及乙醇，因此浸泡后的绿豆在超声-乙醇提取条件下会有大量的咖啡酸溶出造成总酚含量的升高[23]。

浸泡之后的萌发处理显著提高了杂豆总酚含量，在发芽过程中，杂豆总酚含量出现了升高后降低和降低后升高的不同现象，分析原因可能是随着发芽时间的增加，新的植物细胞在新细胞壁形成的情况下增殖，合成的可溶性酚类物质在细胞壁中形成新的结合酚类物质。因此，结合的酚类物质参与动态过程，并且它们的释放和结合速率在不同的发芽种子和芽中可以是不同的[2]。绿豆在发芽过程中总酚的增加量远远高于其他五种杂豆，并且发芽五天后的绿豆的总酚含量是浸泡后绿豆的3.74倍，Huang等[24]在研究中也发现与发芽大豆相比，发芽过程中绿豆的总酚含量相对较高，表明发芽的绿豆相比于其他发芽豆类更容易获得丰富的物质。

2.3 浸泡和发芽对杂豆总黄酮的影响

在自然界中，黄酮类化合物以单糖或多糖部分通过OH基(O-糖苷)或通过碳-碳键(C-糖苷)连接的糖苷形式存在。由表2可知，浸泡和发芽加工方式对6种杂豆中总黄酮含量均影响显著。浸泡处理后，黑大豆、红小豆、绿豆、红芸豆、紫花芸豆的总黄酮降低了6.52%～36.84%，而黑小豆中的总黄酮含量增加了24.47%，这与孙丹等[25]的研究结果相同，浸泡可以显著提高总黄酮含量，原因可能是黑小豆中属于黄酮类化合物的异黄酮含量高于其他豆类，并且异黄酮多以结合型糖苷化合物的形式存在，豆类内部的物质转化和呼吸作用在浸泡过程中开始逐渐加强，细胞内的内源酶被激活，复杂物质能够被酶水解成简单物质。例如如淀粉降解为可溶性糖，大量的结合型糖苷异黄酮被释放出来，从而使总黄酮含量显著升高[26-28]。

表1 浸泡和发芽对杂豆总酚的影响/mg/g

注：数据以干重表示。同行数据相同的小写字母表示没有显著性差异(P>0.05)。余同。

表2 浸泡和发芽对杂豆总黄酮的影响/mg/g

6种杂豆在发芽过程中总黄酮变化幅度不大，因为糖苷配基化合物的浓度不受发芽的影响,并且在发芽的早期阶段，碳水化合物和蛋白质被降解，伴随着单糖和游离氨基酸的增加，因此，与细胞壁成分结合的结合酚类也被释放，而此过程释放的结合酚类可能是杂豆中最多的结合酚类化合物-酚酸而不是黄酮类化合物[1]。

2.4 浸泡和发芽对杂豆总花青素的影响

花青素是水溶性类黄酮色素，浸泡可以使大量的花青素溶出，由表3可知，浸泡处理后的黑大豆、黑小豆、绿豆和紫花芸豆的总花青素降低了18.14%～100% ，而浸泡后的红芸豆中的总花青素升高了196.56%，原因可能是花青素在多酚氧化酶存在下易被酶促降解，而这种酶可以通过浸泡抑制其活性[29]。此外，红芸豆中的一些花青素可能与其他带色物质发生了分子内共色作用使其不易受到水的攻击，但红芸豆在水分子的作用下由静止状态转向活跃状态，不利于共色作用的稳定，大量的花青素在超声提取过程中流出，使测定结果升高[30]。

发芽过程中淋洗会造成花青素大量流失，但六种杂豆的总花青素含量出现了升高或降低的不同现象，Lopez等[31]在豆芽中检测到两种新合成甲氧基化的花青素，即牵牛花素和锦葵色素，二者的形成可能与甲氧基化化合物如阿魏酸及其衍生物的减少有关，这种升高现象归结于酶的作用。花青素的这些不同变化可以通过酚类代谢过程中酶的激活来解释，并且这取决于豆科植物类型和发芽条件[32]。

2.5 浸泡和发芽对杂豆总缩合单宁的影响

由表4可知，浸泡使6种杂豆的总缩合单宁含量降低了15.52%～66.15%。

本实验所用的香草醛-盐酸法适用于测定间苯三酚A环型的原花色素及黄烷醇的含量，说明浸泡使这类缩合单宁大量流失[33]。另外结果表明，发芽后六种杂豆的单宁含量先降低后升高，分析原因可能为发芽可使杂豆内部合成间苯三酚A环型的原花色素或黄烷醇，与花青素相同，新的酚类物质生成可能与酶有关，并且缩合单宁的含量取决于它们的释放和结合速率。

表3 浸泡和发芽对杂豆总花青素的影响

注：ND表示未检测到。

表4 浸泡和发芽对杂豆总缩合单宁的影响

表5 浸泡和发芽对杂豆总抗氧化能力的影响

2.6 浸泡和发芽对杂豆总抗氧化能力的影响

由表5可知，黑大豆、黑小豆、绿豆在浸泡后总抗氧化能力比生豆显著增加了14.00～53.29%，红小豆、红芸豆、紫花芸豆显著减少了9.46%～36.32%。黑大豆在发芽过程中总抗氧化能力变化差异不显著，其他5种杂豆的总抗氧化能力变化差异显著，变化范围为黑小豆0.30～0.39U·mg-1、红小豆0.22～0.38U·mg-1、绿豆0.24～1.13U·mg-1、红芸豆0.24～0.38U·mg-1、紫花芸豆0.37～0.48U·mg-1。

此变化规律大致与浸泡后杂豆的总酚、总黄酮变化一致，而其中一些加工后的杂豆虽然酚类物质含量降低，其总抗氧化能力却显著升高，可能是杂豆中的活性多糖、蛋白质、维生素等结合态物质在加工处理后游离出来[34]。

2.7 相关系数

酚类物质的抗氧化性来源于酚类物质分子中大量的酚羟基，来源于多酚独特的分子结构[35]。由表6可知，生豆和加工后的杂豆的总酚含量与总黄酮和总抗氧化能力呈极显著正相关(P<0.01)。总黄酮与缩合单宁和总抗氧化能力也呈极显著正相关(P<0.01)。然而，花青素与其他指标无显著相关性(P>0.05)，缩合单宁与总酚和总抗氧化能力无显著相关性(P>0.05)。

表6 各指标间的相关系数

注：*P<0.05差异显著;**P<0.01差异极显著。

加工过程中酚类物质发生着复杂的生理生化反应，间接影响抗氧化能力随之变化，但花青素极易降解的特性，致使花青素可能不是加工后杂豆的抗氧化能力的来源，并且加工会促使一些具有抗氧化性的非酚类物质流出，从而使部分酚类物质含量与抗氧化能力不一定呈现相关性。

3 结论

浸泡处理显著降低6种杂豆的总酚、总黄酮、总花青素、总缩合单宁和总抗氧化能力，但浸泡处理可以释放一些结合型酚类物质，从而使浸泡后的绿豆中总酚、黑小豆中总黄酮、红芸豆中总花青素显著升高。与生豆相比，发芽可显著提高黑大豆、黑小豆、绿豆和红芸豆酚类物质含量且在发芽4天或5天出现最大值，对红小豆和紫花芸豆的酚类物质无显著影响或使其显著降低。总抗氧化能力与总酚、总黄酮等指标呈极显著正相关。另外，发芽使杂豆中的花青素显著降低，且花青素含量与其他指标无显著相关性。因此，黑大豆、黑小豆、绿豆和红芸豆可以通过发芽的加工方式来提高酚类物质含量，而发芽不适用于红小豆和紫花芸豆的加工。