Z-没药甾酮联合11-羰基-β-乙酰乳香酸对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的改善作用研究

汪继涛 刘天龙 李玉文

摘 要 目的：研究Z-沒药甾酮（Z-GL）联合11-羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）对脑缺血再灌注损伤模型大鼠的改善作用。方法：将雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和Z-GL+AKBA低、高剂量组（二者低、高剂量均分别为25、50 mg/kg），每组10只。除假手术组外，其余各组均采用线栓法复制大脑中动脉闭塞/再灌注损伤模型。各给药组大鼠均于再灌注后灌胃相应药物，假手术组和模型组大鼠灌胃等容二甲基亚砜，每12 h给药1次，连续7 d。采用改良Longa评分法评价各组大鼠的神经功能缺损情况，采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠脑组织的病理学变化，采用TTC法检测其脑梗死面积并计算脑梗死百分比，采用TUNEL法检测其脑组织中在体细胞凋亡情况，采用免疫荧光染色法、免疫印迹法分别检测其脑组织中CD34、血管内皮生长因子（VEGF）、Delta样配体4（DLL4）的表达情况。结果：与假手术组比较，模型组大鼠脑组织皮层细胞数量减少且排列不规则，可见明显梗死区，并伴有新生血管明显减少;其神经功能缺损评分和脑梗死面积百分比均显著升高，TUNEL阳性细胞数显著增多，CD34、VEGF、DLL4的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠上述症状均有明显改善，其神经功能缺损评分和脑梗死面积百分比均显著降低，TUNEL阳性细胞数显著减少，CD34、VEGF、DLL4的表达水平均显著升高，且Z-GL+AKBA高剂量组神经功能缺损评分、脑梗死面积百分比、TUNEL阳性细胞数均显著低于或少于低剂量组，CD34、DLL4的表达水平均显著高于低剂量组（P<0.05或P<0.01）。结论：Z-GL和AKBA联用可减轻脑缺血再灌注损伤模型大鼠的神经功能缺损，改善其脑损伤;这种作用可能与促进血管新生以及上调VEGF、DLL4蛋白的表达有关，并具有一定的剂量依赖性。

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the improvement effects of Z-guggulsterone （Z-GL） combined with acetyl-11-keto-β- boswellic acid （AKBA） on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Z-GL+AKBA low-dose and high-dose groups （25， 50 mg/kg）， with 10 rats in each group. Except for sham operation group， middle cerebral artery occlusion/reperfusion injury model was induced by suture method in other groups. Administration groups were given relevant medicine intragastrically after reperfusion; sham operation group and model groups were given constant volume of DMSO intragastrically， every 12 h， for consecutive 7 d. The neurological deficits were evaluated with modified Longa score; HE staining was performed to observe the pathological changes of cerebral tissue in rats; the area of cerebral infarction was measured by TTC， and the percentage of cerebral infarction area; TUNEL staining was performed to detect apoptotic neurons. The expression of CD34， VEGF and DLL4 were detected by immunofluoresence and immunoblotting assay， respectively. RESULTS： Compared with sham operation group， the number of cortical cells in the model group decreased and arranged irregularly， with obvious infarct area and obvious decrease of neovascularization; the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and TUNEL positive cells increased significantly， while the expression of CD34， VEGF and DLL4 decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， the above symptoms of the rats in each administration group were significantly improved， the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and the number of TUNEL positive cells were significantly reduced; the expression levels of CD34， VEGF and DLL4 were significantly increased; the neurological deficit score， the percentage of cerebral infarction area and the number of TUNEL positive cells in Z-GL+AKBA high-dose group were significantly lower or less than low dose group; the expression of CD34 and DLL4 in high-dose group was significantly higher than low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Z-GL combined with AKBA can relieve neurological deficit and cerebral injury of cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， which may be related to promoting angiogenesis and up-regulating the expression of VEGF and DLL4 protein， with a certain dose-dependent effect.

KEYWORDS   Cerebral ischemia-reperfusion injury; Z-guggulsterone; Acetyl-11-keto-β-boswellic acid; Angiogenesis; VEGF; Neurological deficit; Rats

缺血性脑卒中是严重危害人类健康的难治性疾病，发病率、致残率和致死率均较高。脑卒中急性期西医溶栓治疗局限性大、风险性高，大多数患者因超过治疗时间窗或其他禁忌证（如严重肝肾功能不全、近3个月有手术病史）而无法获得满意的治疗结局，严重影响了患者的生活质量[1]。中医药治疗脑卒中是中医学历代积累的宝贵财富。由于目前可用以改善患者脑循环的化学药有限，而中医诸多活血化瘀药均具有改善脑循环的作用，且中医治疗恢复期脑卒中患者具有一定的优势，可调节患者整体机能、促进其神经功能恢复，故中西医结合治疗已成为脑卒中治疗的有效途径之一[2]。有研究指出，促进缺血区结构及功能重建以及血管新生和神经再生对慢性恢复期患者的预后至关重要，其中血管新生是其他脑细胞再生的“基石”，但如何有效促进血管新生已成为脑缺血损伤治疗中亟待解决的重大医学难题之一[1]。张锡纯在《医学衷中参西录》中有云，“乳香、没药，为宣通脏腑、流通经络之要药”;又曰“二药合用，气血并治，共奏宣通经络、活血祛瘀、消肿止痛、敛疮生肌之功”[3]。本课题前期已证实，在短暂性大脑中动脉缺血模型大鼠中，没药的主要成分Z-没药甾酮（Z-GL）和乳香有效成分11-羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）均具有显著的抗脑缺血再灌注（CI/R）损伤作用，且Z-GL可有效改善急性血瘀证模型大鼠的凝血和血管内皮功能[4-6]。

目前，Notch信号通路因在血管生成中的重要作用及其与血管内皮生长因子（VEGF）的紧密关联逐渐成为CI/R相关研究的热点。其中，VEGF信号活化可促进Notch4通路的激活和Delta样配体4（DLL4）的表达，而DLL4/Notch4信号的传递则有利于调控新生血管中特定类型细胞的密度和位置，最终确保正常血管的形成[7]。本课题组虽已证实了Z-GL和AKBA的脑保护作用，但考虑到没药、乳香为传统中药药对，二药常相兼而用，且其主要成分联用对脑缺血损伤后血管新生的影响如何尚未见相关报道。为此，本研究拟将没药和乳香的主要成分Z-GL、AKBA作为一个整体，研究二者联用对CI/R后血管新生的影响，并探讨可能的作用机制，旨在为抗脑卒中药物的深入研究和开发提供理论支持。

1 材料

1.1 仪器

BX50/BX-FLA/DP70型光学/荧光显微镜（日本Olympus公司）;RM2235型石蜡组织切片机（德国Leica公司）;552BR型垂直电泳槽、041BR74879型电泳仪电源、GelDoc XR型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）;5810R型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）;D7100型数码相机（日本Nikon公司）。

1.2 药品与试剂

Z-GL对照品（上海甄准生物科技有限公司，批号：12100905，纯度：>98%）;AKBA对照品（美国Sigma公司，批号：21030320，纯度：>95%）;TUNEL法检测试剂盒（批号：C1089）、辣根过氧化物（HRP）标记山羊抗兔IgG二抗（批号：A0208）、山羊血清（批号：C0265）均购自碧云天生物科技研究所;兔抗小鼠CD34抗体（批号：10CM130）、兔抗小鼠VEGF抗体（批号：10CM199）均购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗小鼠DLL4抗体（美国Santa Cruz公司，批号：E1407）;兔抗小鼠β-actin抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号AE071755）;Alexa Fluor® 594标记驴抗兔IgG二抗（批号：A21207）、封片液（批号：P36980）均购自美国Thermo Fisher Scientific公司;不含脱氧核糖核酸酶（DNase）的蛋白酶K试剂（批号：39450）、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色试剂（批号：T8170）均购自北京索莱宝科技有限公司;苏木精-伊红（HE）染色试剂（上海沪峰化工有限公司，批号：G1120）;ECL检测试剂盒（美国Merck Millipore公司，批号：S0100）;其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.3 动物

清洁级雄性SD大鼠，体质量220～280 g，购自空军军医大学实验动物中心[动物使用合格证号：SYXK（陕）2014-001]。

2 方法

2.1 分组、给药与造模

将大鼠随机分为4组，即假手术组、模型组、Z-GL+AKBA低、高劑量组[二者剂量分别均为25、50 mg/kg，以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂。剂量设置参考已有文献[4-6，8-9]：50 mg/kg Z-GL可有效发挥抗异丙肾上腺素致心肌损伤的作用，故以其作为高剂量;将25 mg/kg作为低剂量。此外，没药、乳香为传统中药药对，两者配伍比例为1 ∶ 1，且根据前期急性毒性试验结果判定此剂量均无毒]，每组10只。采用线栓法于室温环境下复制大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）损伤模型：所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL/kg）进行麻醉后，以仰卧位固定，钝性分离颈总动脉、颈内动脉，并于颈总动脉分叉处开小口，将尼龙线沿颈总动脉插入颈内动脉直至有轻微阻力为止（深度约18 mm），造成大脑中动脉闭塞;缺血2 h后，轻轻拔出尼龙线，恢复血流循环实现再灌注。假手术组大鼠除不插入线栓外，其余手术过程相同。造模后，假手术组和模型组大鼠均灌胃等容DMSO，各给药组灌胃相应药物，每12 h给药1次，连续7 d。

2.2 神经功能缺损评分

末次给药后，根据改良Longa评分法评价各组大鼠的神经功能缺损情况。评分标准——0分：四肢活动正常，无神经功能缺损;1分：尾部垂直提起大鼠时可见左前爪呈屈曲状态，不能伸直;2分：平地行走时大鼠向左侧倾斜，身体可向左侧旋转转圈;3分：行走不稳，整个身体向左侧倾倒;4分：有意识障碍或不能自主行走[10]。根据首次神经功能缺损评分结果，将评分0分或4分、死亡、呼吸困难、生命体征不平稳或处死后发现有颅内出血的造模动物弃之不用，最终每组取6只大鼠进行后续研究。

2.3 组织病理学观察

采用HE染色法。所有大鼠麻醉后处死，取脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。经脱水、透明、浸蜡、包埋成蜡块，行冠状切片（厚度约5 μm）。切片经二甲苯脱蜡、不同浓度乙醇脱水后，依次用苏木精、伊红试剂染色，置于显微镜下观察各组大鼠脑组织的病理学变化。

2.4 脑梗死面积检测

采用TTC法。取大鼠脑组织，由心尖至心基底部将心室切成厚约2 mm的心肌切片，置于3%TTC試剂中，于37 ℃避光染色30 min，再于4 ℃预冷的4%多聚甲醛溶液中固定2 h。使用数码相机拍照后以Image-Pro Plus 6.0软件处理，并计算脑梗死面积百分比（脑梗死区为白色，正常脑组织为红色），脑梗死面积百分比=（总对侧半球面积-同侧半球总染色面积）/对侧半球总面积×100%。

2.5 在体细胞凋亡情况检测

采用TUNEL法。取大鼠脑组织，按“2.2”项下方法石蜡包埋后，切片（厚度约5 μm），经脱蜡、脱水后，加入20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K试剂，于20～37 ℃下反应15～30 min;用pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，加入TUNEL检测试剂50 μL，于37 ℃避光孵育1 h;用PBS清洗3次，以封片液封片后置于显微镜下观察，记录视野中TUNEL染色阳性细胞（即染成棕色的凋亡细胞）的数量。

2.6 脑组织中CD34表达情况检测

采用免疫荧光染色法。取大鼠脑组织，按“2.2”项下方法石蜡包埋后，切片（厚度约5 μm），并于65 ℃烤片2 h后，常规脱蜡;柠檬酸盐修复20 min，置于3%过氧化氢溶液中浸泡10 min以灭活内源性过氧化物酶;用PBS清洗5 min×3次;滴加山羊血清封闭15 min，弃去上清;加入CD34抗体（稀释度为1 ∶ 200），4 ℃孵育过夜;PBST溶液清洗5 min×3次;加入Alexa Fluor® 594标记驴抗兔IgG二抗（稀释度为1 ∶ 500），37 ℃孵育1 h;PBST溶液清洗5 min×3次，中性树胶封片后置于荧光显微镜下观察，使用Image Pro Plus 6.0软件处理，以CD34阳性表达细胞（即染色后呈红色的细胞）的荧光强度表示CD34的表达水平。上述试验重复3次。

2.7 脑组织中DLL4、VEGF蛋白表达情况检测

采用免疫印迹法。取大鼠脑组织，采用研磨法提取蛋白适量，于95 ℃变性后，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后转移至PVDF膜上，以5%脱脂牛奶封闭30 min。加入相应一抗（DLL4、VEGF、β-actin的稀释度分别为1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000），4 ℃孵育过夜;用TBST溶液清洗3次，加入HRP标记山羊抗兔IgG二抗（稀释度为1 ∶ 2 000），37 ℃孵育1 h;TBST溶液清洗3次，以ECL检测试剂盒显色后，置于凝胶成像系统上成像并使用Quantity One v.2.0软件处理，以相应蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示该蛋白的表达水平。上述试验重复3次。

2.8 统计学方法

采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据均以x±s表示，采用单因素方差分析（ANOVA）或Bonferroni检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠神经功能缺损评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高（P<0.05）;与模型组比较，各给药组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，且高剂量组显著低于低剂量组（P<0.01），详见表1。

3.2 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠脑组织病理学的影响

假手术大鼠皮层细胞排列有序，且细胞结构清晰、致密，核仁清晰可见;模型组大鼠大脑皮层缺血灶周围细胞数量明显减少，且排列不规则，大多数核皱缩;各给药组大鼠上述症状均较模型组有所好转，详见图1。

3.3 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠脑梗死区的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织可见明显的灰白色梗死区，其脑梗死面积百分比显著升高（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠的脑梗死区均有所缩小，脑梗死面积百分比均显著降低，且高剂量组显著低于低剂量组（P<0.01），详见图2、表1。

3.4 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠TUNEL阳性细胞数的影响

假手术组大鼠脑组织中未见或可见少量TUNEL阳性细胞;模型组大鼠脑组织中可见大量TUNEL阳性细胞，其数量较假手术组显著增加（P<0.01）;各给药组大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞明显减少，其数量均较模型组显著减少，且高剂量组显著少于低剂量组（P<0.05或P<0.01），详见图3（图中，箭头表示TUNEL阳性细胞）、表1。

3.5 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠脑血管新生的影响

假手术组大鼠脑组织中血管丰富，形态清晰;模型组大鼠脑组织中新生血管明显减少，CD34的表达水平较假手术组显著降低（P<0.01）;各给药组大鼠脑组织中新生血管明显增多，CD34的表达水平均较模型组显著升高，且高剂量组显著高于低剂量组（P<0.05或P<0.01），详见图4、表2。

3.6 Z-GL+AKBA对MCAO/R损伤模型大鼠脑组织中VEGF、DLL4表達的影响

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中VEGF、DLL4的表达水平均显著降低（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中VEGF、DLL4的表达水平均显著升高，且高剂量组DLL4的表达水平显著高于低剂量组（P<0.05或P<0.01），详见图5、表2。

4 讨论

乳香、没药作为经典的活血化瘀药对，多见于名家典籍[11]。《本草纲目》言，“乳香活血、没药散血，皆能止痛、消肿、生肌”;《海药本草》记载，二者“主折伤马坠，推陈出新，能生好血，研烂，以热酒调服”;《本草述》曰，“久服舒筋膜，通血脉，固齿牙，长须发”，故二药每每相兼而用。同时，没药、乳香也作为药对常见于中成药或方剂（如活络效灵丹、脑心通胶囊）中。没药、乳香的有效成分Z-GL、AKBA均具有明显的抗CI/R损伤作用，但尚未见两种成分联用效果评价的相关文献。为此，本文在前期研究的基础上，对两药有效成分对MCAO/R损伤模型大鼠的改善作用及其对大鼠新生血管的影响进行了初步探讨。

血管新生属于中医学“生脉”范畴。益气活血生脉也包含有“祛瘀生新”的含义，瘀血去，则新血及新脉生，生新脉又反过来促进瘀血祛除[12]。许多中药单体、单味药及中药复方都具有很好的促进血管新生的作用：余小平等[13]发现，复方丹参片可通过增加急性脑缺血模型大鼠脑内VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，从而促进缺血组织侧支循环的建立、改善神经功能;田兆华等[14]发现，补阳还五汤可调节局灶性脑缺血模型大鼠脑缺血区VEGF等的表达，增强血管内皮细胞的趋化作用，并促进其增殖、移行和分化以确保新生血管网络的建立。本研究采用MCAO/R损伤大鼠模型，考察了Z-GL+AKBA的脑保护作用。结果显示，假手术组大鼠未见神经功能异常，皮层细胞排列有序，无明显脑梗死区，未见或可见少量TUNEL阳性细胞。造模后，模型组大鼠大脑皮层缺血灶周围细胞数量明显减少，且排列不规则，可见明显的脑梗死区和大量的TUNEL阳性细胞，其神经功能缺损评分、脑梗死面积百分比、TUNEL阳性细胞数均显著升高。经Z-GL+AKBA处理后，各给药组大鼠上述症状均有所好转，其神经功能缺损评分、脑梗死面积百分比、TUNEL阳性细胞数均显著降低，且Z-GL+AKBA高剂量组上述指标均显著低于低剂量组。这提示二者联用可减轻模型大鼠的神经功能损伤，减少在体细胞凋亡，缩小其脑梗死面积，并具有一定的剂量依赖性。

脑缺血后血管新生是由多种细胞因子和信号通路共同参与的动态的、复杂的生理过程。其中，Notch信号网络在调节血管出芽和分支形成，调控动静脉形成、内皮祖细胞分化和血管平滑肌细胞的成熟稳定的过程中发挥着重要的作用[7]。在血管新生的调节通路中，配体Jagged1和DLL4通过与Notch4竞争性结合，共同调控血管新生相关信号的转导[15]。Gridley T等[16]发现，内皮细胞DLL4表达上调，可激活邻近细胞Notch4受体，启动细胞内信号转导，诱导靶基因Hes3、Shh表达，促使血管形成。更深入的研究表明，减少VEGF的表达可使DLL4的表达受到抑制，最终导致内皮细胞增殖、迁移和血管网络形成受阻。这提示VEGF-DLL4信号通路对调节Notch级联信号转导通路、保证正常血管生成具有重要意义[17]。本研究结果显示，模型组大鼠脑组织中的新生血管明显减少，CD34、VEGF、DLL4的表达水平均显著降低。经Z-GL+AKBA处理后，大鼠脑组织中的新生血管有所增多，CD34、VEGF、DLL4的表达水平均显著升高，且Z-GL+AKBA高剂量组CD34、DLL4的表述水平均显著高于低剂量组。这提示二者联用可促进血管内皮标志物（CD34）的表达，促进血管新生，并上调VEGF、DLL4的表达，且具有一定的剂量依赖性。

综上所述，Z-GL和AKBA联用可减轻MCAO/R损伤模型大鼠的神经功能缺损，改善其脑损伤;这种作用可能与促进血管新生以及上调VEGF、DLL4蛋白的表达有关。本研究为没药-乳香药对治疗脑卒中提供了实验基础，但具体机制尚有待后续研究进一步完善;此外，乳香、没药配伍后，其有效成分（尤其是Z-GL、AKBA）是否会发生变化，也有待于后续研究深入探讨。

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（收稿日期：2019-07-12 修回日期：2019-11-25）

（编辑：张元媛）