獐的消化道微生物探索

王怡然

[关键词]獐;消化道;微生物

肠道微生物，是指动物肠道内全部的、复杂的、动态变化的微生物群落，肠道微生态系统与宿主的营养、代谢和免疫等方面密切相关。动物并不是一个单纯的个体，与动物伴生着的，是寄生于动物里的数量庞大的细菌们。它们广泛分布在我们的口腔、肠道、皮肤、眼角膜、生殖道等几乎身体的各处。很多时候是多种菌交叉互利共生，组成一个复杂的体系，往大了说，组成的是一个生态系统，而且专门适应于某种特定动物的肠道。因此，研究物种消化道微生物是了解这一关系的重要起点。

1919年，科学家发现了埃希氏细菌，这一发现标志着人们对消化道微生物奥秘探索的开始。从此，人们开始大量研究消化道微生物，这些研究主要集中在探究消化道菌群与宿主之间的关系。从而研究了消化道微生物的组成结构、群落多样性和一些生理特性问题（Smriga et al，2010）。随着研究技术的发展，特别是分子生物学的快速发展，消化道微生物的研究也迅猛发展。近年来，对消化道微生物的研究主要集中在家禽家畜、实验动物、野生动物、昆虫和人中，从高等白蚁消化道中分离到的多种异养型细菌，大多数为兼性厌氧菌（陈虹，2005），有的甚至是严格好氧菌，包括链球菌（Streptococcus sp.）、拟杆菌（Bacteroids sp.）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、葡萄球菌（StaphylOCOCCl，8sp）和芽胞桿菌（Bacilus sp）（黄云，2009）。Bairagi等人（Bairagi，2002）的相关研究表明，常见的草鱼（Ctenopharyngodon idellus）、鲤鱼（Cypnnus carpio）、罗非鱼（Oreochromis mossambica）等9种鱼类的消化道中，一些好氧细菌同时也具有分泌消化酶的功能，分泌的消化酶种类主要有淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等。当人们知道了消化道微生物对生物体的健康与疾病的关系之后，很多微生物制剂被应用到健康领域、医学领域、环境保护、分子生物领域等。消化道微生物的研究会越来越多，为我们揭示更多与寄主的关系，更多的造福人类。

消化道微生物参与动物体的生长、发育、消化、吸收、营养、免疫、生物拮抗及其它各个方面的功能和结构的发生、发展和衰退的全过程（Ley et al.，2008）。其数量庞大，在成人消化道中，大约栖息着500种细菌，数量达到了1012-1014个，是人体自身细胞数量的10倍（Mcfall-Ngaiet al，2013）。

1研究对象

獐，为研究对象。又名河麂、毛獐、牙獐，偶蹄目、鹿科、獐亚科，是国家二级野生重点保护动物，IUCN红色名录易危等级。本实验的目的是：探索獐消化道里微生物的种类。

2实验方法

通过野外采样：1.解剖采集消化道样本，胃、十二指肠、回肠、结肠、盲肠。采集地址：崇明岛明珠湖公园、松江浦南林地、浦东华夏公园。2采集粪便样本（上海动物园）3.DNA提纯：用土壤动物DNA提纯试剂盒提纯DNA。4高通量测序以及数据分析等过程完成实验。

3统计方法

3.IOTU聚类分析法：对测序结果进行OTU聚类分析。OTU聚类分析：OTU（Operational Taxonomic Units）是为了便于研究人员进行分析，在群体遗传学或系统发生学科研究中，人为的为某一个分类单元（比如品系，属，种、分组等）设置的一个同一标志。如果要了解一个样本测序结果里细菌的种或属数目信息，就必须对结果所得序列进行归类操作（cluster）。然后通过归类操作，再将序列按照样本彼此的相似性，进行分成各个小组，每个小组即为一个OTU。可根据样本中序列不同的相似度水平，对所有样本序列进行OTU归类划分，一般是先选择在97%的OTU相似水平序列，再进行生物信息统计学分析。利用Usearch软件进行处理。

分析方法具体为：先对优化序列提取序列中的非重复部分，这样方便降低分析中间过程时的冗余计算量，然后再去除没有重复的单序列，对非重复序列（不包含单序列），按照97%的相似性，对OTU进行聚类分析，在聚类分析的过程中，注意要去除嵌合体，然后便可得到OTU的代表序列。把所有的优化序列map到OTU代表序列中，然后选出相似性在97%以上的序列为代表序列，进而生成OTU表格。为得到所有OTU对应的物种分类上的信息，采用RDP classifier贝叶斯算法，对OTU代表序列（97%相似水平）进行统计分类分析，并在所有水平进行统计每个样品的群落构成。

选择以下几个数据库：16s细菌和古菌核糖体数据库（在没有特别指定时，可默认使用silva数据库）（Silva et al，2013）CReleasel23http：//www.arb-silva.de），RDP（Cole et al，2009）（Release 113http：//rdp.cmemsu.edu/）;18S真菌数据库：Silva（Qnast et al，2013）;ITS真菌数据库：Unite（Urmaset al，2013）;功能基因：FGR（Jordanetal，2013）;RDP的整理来自于GeneBank的功能基因数据库。

3.2多样性指数分析。群落生态学中的研究微生物群落多样性，通过对每个样品进行多样性分析（Alpha多样性），便可以反映微生物的群落多样性和物种丰度，还包括应用一系列的统计生物学分析指数来估计环境群落的物种丰度和多样性。

Shannon指数：可用来估算样本中微生物群落多样性，并且可以与Simpson多样性指数来反映alpha生物多样性指数。在Shannon值越大时，群落多样性就越高。使用的软件：mothur（Schloss et al，2011）。

3.3绘制香农威纳（sharmon-Wiener）曲线，所使用软件：以97%相似度水平的OTU为基础，使用mothur来计算不同的随机抽样下的得到的shannon值，然后利用R语言工具，绘制曲线图。

Shannon-Wiener指数是用来反映样品中微生物群落多样性的一个指标（YuWanget al 2012）。以各样本的测序量为基础，构建在不同测序深度时的微生物群落多样性指数曲线，以此来反映在不同测序数量时，各个样品的微生物群落多样性情况。当香农威纳曲线趋于平坦时，此时说明测序数据量足够大，并可以反映已经包含了样品中的绝大多数的微生物多样性信息。

3.4绘制稀释性曲线（Rarefaction curve），所使用软件是：依然是以97%相似度的OTU为基础，并做mothur做rarefaction分析，然后通过R语言工具来制作曲线图。

4实验结论

獐的消化道和粪便中的微生物，可测出的含量超过1%的微生物一共有约16个门。消化道里有104个属，粪便里有113个属。（自然界中食草动物平均140多个属，食肉动物平均92个属。

5讨论

壁菌门为革兰氏阳性，是人体及高等哺乳动物肠道内最为优势的一大类细菌，比例约占总菌群的50-60%（Subnmgrnang et al，2004：Schuurman et al，2007;Zoetendal et al，2001）。厚壁菌门中的部分细菌对多糖的代谢和对于宿主的能量供应及肠上皮细胞的发育有重要作用（Hooper et al，2001）。在未补盐实验中成獐的回肠、结肠优势菌都是厚壁菌门，且胃部第二大优势菌也是厚壁菌门，它们或许对獐的多糖代谢、能量供应以及细胞的发育起到了一定的作用。

拟杆菌门是人体肠道内第二大优势类群，数量仅次于厚壁菌门。这一类细菌属于革兰阴性的严格厌氧菌，具有碳水化合物发酵、参与胆汁酸和类固醇代谢、维持肠道正常生理等诸多功能，对人体健康具有重要影响（schloss et al，2005）。并且其中的部分细菌还能够降解人体不能代谢的植物多糖，为宿主提供能量（schloss et al，2005）及抵御肠侵人性病原菌的粘附等功能（Dyszynski et al，2006）。无论在未补盐或补盐实验中，我们发现獐消化道和粪便中拟杆菌门含量较高，拟杆菌门可能也会在獐的消化道中对糖代谢、胆汁酸及类固醇的代谢和维持肠道正常生理等方面起到了一定的积极作用。