杜长大猪UCP3基因克隆及白藜芦醇对其表达的影响

崔悦悦 张广杰 徐晓芙 夏琴 邹辉 江雨航 瞿秋红 蒋钦杨 黄艳娜 郭亚芬 兰干球

摘要：【目的】明确白藜芦醇对杜长大猪UCP3基因表达及脂肪代谢的影响，为揭示猪优良肉质性状形成机制打下基础。【方法】提取2月龄杜长大猪皮下脂肪组织RNA，采用RT-PCR扩增杜长大猪UCP3基因编码区（CDS）序列，运用在线软件对其进行生物信息学分析，并以实时荧光定量PCR检测白藜芦醇（400 mg/kg，饲喂30 d）对杜长大猪脂肪中UCP3基因表达的影响。【结果】从杜长大猪皮下脂肪组织中成功克隆获得UCP3基因CDS序列，全长927 bp，共编码308个氨基酸，其蛋白分子质量33673.09 Da，理论等电点（pI）9.44;与普通猪的UCP3基因序列相比，杜长大猪UCP3基因编码序列共有9处发生碱基突变，其中4处为错义突变，导致UCP3蛋白有4处氨基酸突变，分别为第74位脯氨酸（Pro）→亮氨酸（Leu）、第150位甘氨酸（Gly）→精氨酸（Arg）、第203位Arg→Gly和第259位缬氨酸（Val）→Leu。杜长大猪UCP3基因CDS序列与普通猪UCP3基因CDS序列的同源性为99.0%，其UCP3蛋白二级结构中以α-螺旋占比最高（46.43%）、β-转角占比最低（7.47%），属于亲水性蛋白。饲喂白藜芦醇（400 mg/kg）能极显著上调杜长大猪皮下脂肪UCP3基因表达（P<0.01），其相对表达量是对照组（不饲喂白藜芦醇）的2.06倍。【结论】白藜芦醇是通过上调杜长大猪UCP3基因表达而影响其脂肪代谢。

关建词： 杜长大猪;解偶联蛋白（UCP）;UCP3基因;生物信息学分析;白藜芦醇;基因表达

中图分类号： S828.89                  文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0439-07

0 引言

【研究意义】解偶联蛋白（Uncoupling protein，UCP）主要分布在线粒体内膜上，参与机体的能量代谢，且是影响肉质的关键基因（丛军和高弼虎，2012），即开展UCP研究可为培育低脂肪的优良肉质畜禽品种打下理论基础。猪肉产品在畜禽食品中占据重要地位，尤其是我国作为全球第一大猪肉生产和消费国家，猪肉产量和消费量逐年递增。据统计，2017年我国的猪肉产量和消费量分别为5340万和5487万t。但随着人们生活水平的提高，对猪肉品质的要求也越来越高，因此在猪生产中如何获得量多且质优的肉类产品已成为养猪育种工作者的首要任务。【前人研究进展】目前，已发现有5种UCP家族蛋白（UCP1～UCP5），且研究证实UCP3与UCP1不仅具有高度同源性，还与产热机能相关，但具体机制尚不明确（孔勇等，2010;高文荣等，2012）。Gong等（2000）、Seifert等（2008）通过对动物脂肪酸代谢过程的研究，发现UCP3能减缓线粒体氧化应激反应，增强脂肪酸氧化，减少脂肪沉积。刘颖等（2013）研究表明，UCP3在动物脂肪代谢合成过程中发挥重要作用，可将能量转化为热能。白藜芦醇（Resveratrol，RES）多存在于虎杖、花生和葡萄籽等植物中（韦晓等，2018），是一种无色无味针状结晶、难溶于水但易溶于有机溶剂的多酚化合物（韩晶晶等，2008）。孙延权等（2011）研究表明，白藜芦醇具有减轻肥胖小鼠体重、上调脂肪组织Sirt1基因表达及降低体内脂肪含量的作用。王晓珂等（2013）研究表明，白藜芦醇通过促进肥胖易感大鼠脂肪组织中AMPKα1、AMPKα2和Sitr1基因的表达，而降低高脂膳食诱导肥胖易感大鼠的体重和脂肪蓄积量。王筱婧等（2015）研究发现，白藜芦醇对大鼠急性酒精性肝损伤有保护作用，其机制可能与清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤及抑制炎症反应水平有关。郑新杰等（2017）研究证实，高脂膳食摄入和尼克酰胺会抑制脂肪代谢相关蛋白基因Sirt1、PPARγ和UCP1的表达，但经白藜芦醇干预处理后能上调UCP1基因表达，并减轻小鼠体内白色脂肪组织的重量。【本研究切入点】目前，已有研究证明白藜芦醇和UCP3基因均与机体脂肪代谢相关，但通过饲喂白藜芦醇能否调控猪UCP3基因表達进而影响脂肪代谢的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆杜长大猪UCP3基因并对其进行生物信息学分析，同时通过实时荧光定量PCR检测白藜芦醇能否调控UCP3基因表达，明确其对猪脂肪代谢的影响，为揭示猪优良肉质性状的形成机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1月龄杜长大猪由广西大学动物科学技术学院科研基地养殖场（许可证号GXU2013002）提供，共8头，随机分为饲喂白藜芦醇组（400 mg/kg）（Zhang et al.，2015）和对照组（不饲喂白藜芦醇）。饲喂30 d后进行屠杀采样，采取皮下脂肪组织立即置于液氮中，然后转移至-80 ℃冰箱储存备用。pMD19-T载体、RNAiso Plus、荧光定量反转录试剂盒和SYBRⅡ等均购自TaKaRa公司;DNA聚合酶和普通反转录试剂盒等购自南京诺唯赞生物科技有限公司;胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母浸出物和胰蛋白胨等购自OXOID公司;琼脂糖购自法国Biowest公司;氨苄西林、氯化钠和氯化钾等购自上海华舜生物技术有限公司;白藜芦醇（PHLC≥98%）购自陕西慈缘生物技术有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1. 2 PCR引物设计与合成

依据NCBI中已发表的猪UCP3基因序列（NM_214049.1），利用Oligo 7.0设计引物，包括克隆引物UCP3-F1、UCP3-R1及定量引物UCP3-F2和UCP3-R2，以18S rRNA为内参基因（表1），其中克隆引物扩增片段中的5'端和3'端均包含非翻译区。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 杜长大猪UCP3基因克隆

以TRIzol法提取杜长大猪皮下脂肪总RNA，并按反转录试剂盒说明进行反转录合成cDNA，反转录体系8.0 μL：1.0 μL Oligo（dT）23VN（59 μmol/L），10 pg～50 μg RNA，RNase Free H2O补足至8.0 μL。反应程序：65 ℃ 5 min，冰浴2 min。继续在反应体系中加入10.0 μL的2×RT Mix和2.0 μL HiscriptTM II Enzyme Mix。反应程序：55 ℃ 45 min;85 ℃ 5 min;4 ℃保存。以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系10.0 μL：5.0 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL cDNA模板（308.3 ng/μL），UCP3-F1和UCP3-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，双蒸水补足至10.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，然后切取目的条带，按胶回收试剂盒说明对目的条带进行纯化回收。回收的目的片段与pMD19-T载体连接后置于4 ℃下过夜，连接产物与40.0 μL DH5α感受态细胞混匀，冰浴30 min后42 ℃水浴45 s，最后冰浴2 min;加入500.0 μL LB液体培养基，于37 ℃下摇床振荡（200 r/min）培养1 h;取100.0 μL菌液涂布于含氨苄青霉素（0.1 mg/mL）的LB固体培养基上，倒置培养10～12 h。从LB固体培养基上挑选单个白色菌落进行扩大培养，将PCR鉴定呈阳性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1. 4 杜长大猪UCP3基因生物信息学分析

首先利用MegAlign对克隆获得的杜长大猪UCP3基因与参考猪序列进行比对分析，同时与奶牛（Bos taurus，NM_174210.4）、斑马鱼（Danio rerio，NM_200353.2）、人类（Homo sapiens，U84763.1）、小鼠（Mus musculus，AB010742.1）、褐家鼠（Rattus norvegicus，U92069.1）和普通猪（Sus scrofa，NM_2140 49.1）6个物种的UCP3基因进行同源性比对分析;采用LaserGene构建多物种系统发育进化树;以ExPASy ProPtaram（http：//web.expasy.org/protparam/）系统分析杜长大猪UCP3基因编码蛋白的一级结构、分子量和等电点;利用ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/prot）进行UCP3蛋白亲/疏水性预测分析;通过NPS@在线蛋白分析系统（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）对杜长大猪UCP3基因编码蛋白的二级结构进行预测分析，并利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）对其三级结构进行预测分析。

1. 5 qRT-PCR检测UCP3基因表达情况

1. 5. 1 杜长大猪皮下脂肪cDNA合成 以TRIzol法提取8头猪的皮下脂肪总RNA，并按反转录试剂盒说明进行反转录合成cDNA。反转录体系10.0 μL：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL gDNA Eraser，1.0 μg总RNA，RNase Free H2O补足至10.0 μL。反应程序：42 ℃ 2 min。继续在体系中加入1.0 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1.0 μL RT Prime Mix、4.0 μL 5×Primescript Buffer和4.0 μL RNase Free H2O。反应程序：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃保存。

1. 5. 2 qRT-PCR检测UCP3基因 以反转录合成的cDNA为模板进行qRT-PCR。反应体系20.0 μL：10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，UCP3-F2/UCP3-R2（10 μmol/L）各0.5 μL，5.0 μL cDNA模板（5 ng/μL），4.0 μL RNase Free H2O。擴增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行35个循环。以CFX-96（Bio-RAD）进行检测，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1. 6 统计分析

用Excel 2010对试验数据进行初步处理，使用SAS 9.1进行统计分析，再以GraphPad Prism 7.0制图。

2 结果与分析

2. 1 杜长大猪UCP3基因PCR扩增结果

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果在1000 bp附近出现单一明亮的目的条带，与预期结果相符。纯化的目的条带经扩大培养后，其菌液PCR鉴定结果也显示在1000 bp附近出现目的条带，与预期序列长度1009 bp基本吻合。

2. 2 杜长大猪UCP3基因生物信息学分析结果

2. 2. 1 UCP3基因序列比对分析结果 利用Meg-Align对杜长大猪UCP3基因与NCBI中已发表猪的UCP3基因进行序列比对分析，结果发现杜长大猪UCP3基因序列长927 bp，相对于参考猪的UCP3基因序列，杜长大猪UCP3基因编码区（CDS）序列共有9处发生碱基突变，分别是第117位 C→T、第211位C→T、第306位T→C、第444位 G→T、第448位A→G、第555位T→C、第564位G→C、第607位G→T和第776位T→C。其中5处（第117、306、444、555、564位）为同义突变，剩余4处则发生错义突变，具体表现：第221位C→T致使第74位脯氨酸（Pro）→亮氨酸（Leu）;第448位A→G致使第150位甘氨酸（Gly）→精氨酸（Arg）;第607位G→T致使第203位Arg→Gly;第776位T→C致使第259位缬氨酸（Val）→Leu。

2. 2. 2 UCP3基因同源性比对分析结果 通过MegAlign比对分析杜长大猪与NCBI中其他物种的UCP3基因同源性，结果表明，杜长大猪UCP3基因CDS序列与奶牛、斑马鱼、人类、小鼠、褐家鼠和普通猪的UCP3基因CDS序列同源性分别为90.0%、68.8%、87.3%、83.6%、84.0%和99.0%。

2. 2. 3 系统发育进化树 使用MegAlign构建基于UCP3基因同源性的系统发育进化树，结果显示杜长大猪与普通猪具有非常近的亲缘关系，而与斑马鱼的亲缘关系最远。

2. 2. 4 UCP3蛋白一级结构预测结果 经ExPASy ProPtaram分析可知，杜长大猪UCP3基因共编码308个氨基酸，其蛋白分子质量33673.09 Da，理论等电点（pI）9.44。杜长大猪UCP3蛋白的氨基酸组成成分如表2所示。

2. 2. 5 UCP3蛋白二级结构预测结果 利用NPS@在线蛋白分析系统预测杜长大猪UCP3蛋白二级结构。杜长大猪UCP3蛋白二级结构中，α-螺旋（用h表示）占46.43%，β-转角（用t表示）占7.47%，延伸链（用e表示）占15.26%，无规则卷曲（用c表示）占30.84%。

2. 2. 6 UCP3蛋白三级结构预测结果 利用SWISS-MODEL对杜长大猪UCP3蛋白三级结构进行预测，以α-螺旋为主，与UCP3蛋白二级结构预测结果一致。

2. 2. 7 UCP3蛋白亲/疏水性预测分析结果 利用ExPASy ProtScale对杜长大猪UCP3蛋白的亲/疏水性进行预测分析，图中纵坐标代表疏水性分值，分值越高表明蛋白疏水性越强。杜长大猪UCP3蛋白的亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故属于亲水性蛋白。

2. 3 白藜芦对杜长大猪UCP3基因表达的影响

饲喂白藜芦醇（400 mg/kg）能极显著上调杜长大猪皮下脂肪UCP3基因表达（P<0.01），其相对表达量是对照组的2.06倍。

3 讨论

UCP3是线粒体内膜中一类非常关键的转运蛋白，与骨骼肌线粒体的产热调节有着密切关联（安建多和江瑛，2013;杨占清等，2013）。Fabris等（2001）研究证实，大鼠血浆游离脂肪酸的升高能有效提高大鼠骨骼肌中UCP2和UCP3 mRNA的表达水平，进而影响脂肪堆积。赵建国等（2002）研究表明，血浆中游离脂肪酸的增加可上调白色脂肪及骨骼肌中UCP2和UCP3基因的表达。丛军和高弼虎（2012）研究发现，UCP2和UCP3蛋白对动物机体能量平衡状态的保持具有重要作用，且对体重及体脂代谢等相关性状产生明显影响。本研究从杜长大猪皮下脂肪中成功克隆获得UCP3基因，通过与已报道的猪UCP3基因序列进行比对，发现杜长大猪UCP3蛋白有4处氨基酸突变，分别为第74位Pro→Leu、第150位Gly→Arg、第203位Arg→Gly和第259位Val→Leu;基于UCP3基因同源性构建的系统发育进化树显示，杜长大猪与普通猪具有非常近的亲缘关系，二者的同源性为99.0%。相对于普通猪，杜长大猪UCP3基因碱基发生错义突变导致的氨基酸突变是否影响其生物学功能，尚有待于进一步探究。

陈峰等（2010）研究表明，经白藜芦醇干预后能有效抑制高糖诱导的氧自由基生成，同时上调小鼠细胞中UCP5基因表达。周逸亭等（2014）研究表明，经白藜芦醇饲喂的小鼠体内UCP1基因表达水平升高，体重减轻，糖代谢得到一定改善，还能促进其白色脂肪褐色化。于飞（2015）研究表明，白藜芦醇可改善小鼠的脂肪代谢，对其体内外脂肪代谢均有不同程度的影响，促使高脂日粮饲喂条件下小鼠肝脏脂肪变性的风险降低，说明白藜芦醇与脂肪代谢紧密相连。郑新杰等（2017）研究发现，白藜芦醇干预处理小鼠体内脂肪细胞的体积减小，脂质蓄积减少。可见，白藜芦醇是通过调控UCP3基因表达而影响机体脂肪沉积。本研究结果表明，饲喂白藜芦醇（400 mg/kg）30 d后，杜长大猪皮下脂肪UCP3基因极显著上调表达，其相对表达量是对照组的2.06倍，说明白藜芦醇是通过上调猪UCP3基因表达而影响其脂肪代谢，但具体作用机制还需进一步研究。

4 结论

杜长大猪UCP3基因CDS序列与参考猪的UCP3基因CDS序列同源性最高，亲缘关系最近，仅有4处碱基发生错义突变。饲喂白藜芦醇（400 mg/kg）能极显著上调杜长大猪皮下脂肪UCP3基因表达，说明白藜蘆醇是通过上调猪UCP3基因表达而影响其脂肪代谢。

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（責任编辑 兰宗宝）