广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建及其相关生物信息学分析

黄叶 吴延军 朱思燃 奉玲丽 瞿秋红 江雨航 夏琴 崔悦悦 莫家远 兰干球

摘要：【目的】构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子（CTGF）基因真核表达载体并鉴定其活性，为深入研究CTGF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考，也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因，并将CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上，然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞，转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白，同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析。【结果】成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区（CDS）序列，序列全长1050 bp，共编码349个氨基酸，与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%，有5处碱基突变，且均为同义突变。将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体，转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达。广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性，其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。【结论】广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定，通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达，可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型。

关键词： 广西巴马小型猪;CTGF基因;小鼠Hep3B细胞;脂质体转染;生物信息學

中图分类号： S828.89                                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0468-09

0 引言

【研究意义】结缔组织生长因子（Connective ti-ssue growth factor，CTGF）是一种新发现可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积的生长因子，是CCN家族的成员之一（包晶晶等，2013）。CTGF合成蛋白为肝素结合型，可分泌含有高水平半胱氨酸的多功能蛋白，其分子量为36～38 kD。CTGF也被认为是TGF-β的下游介质，在人类多种组织器官中广泛表达，与肿瘤的发生发展相关（Gorlov et al.，2010;Volkomorov et al.，2013）。CTGF的主要作用是刺激成纤维细胞增殖，且是分泌胶原的生长因子（佟仲生等，2010）。近年来的研究结果显示，CTGF除了在慢性炎症、血管和纤维化生成方面发挥重要作用外（柏秀玉等，2016），其在调节细胞增殖、肿瘤发生发展等方面也扮演重要角色（Finger et al.，2014;Zhu et al.，2015）。因此，加强CTGF基因研究对研发治疗由CTGF引发的癌症药物及揭示其治疗机制均具有重要意义。【前人研究进展】CTGF对信号传导的调节是通过抑制或促进其他生长因子活性来完成（Inoki et al.，2002）。Deng等（2007）研究表明，CTGF高表达可促进裸鼠食管癌细胞的生长和肿瘤的形成、增长及浸润。Kwon等（2007）研究证实，CTGF在不同细胞类型中均由TGF-β诱导，且发现在胰腺癌和细胞系中会造成CTGF表达受损。Bennewith等（2009）研究表明，CTGF可保护细胞免受缺氧介导的细胞凋亡，为表达高水平CTGF的肿瘤细胞提供体内选择。Cawthorn等（2009）研究证实，CTGF在骨骼的发育、塑形、重塑及软骨的发生过程中也发挥一定作用，并通过旁分泌机制刺激MDA2231癌巢的血管形成，而有助于乳腺癌的侵袭及转移。Ren等（2013）研究表明，CTGF能促进尤文肉瘤细胞的增殖、迁移和转移。Tai等（2014）研究发现，CTGF在黑色素瘤和前列腺癌细胞的发育过程中具有抑制功能;贺小玉和田应选（2015）也研究表明CTGF在非小细胞肺癌中可能发挥抑制肿瘤作用;但Ma等（2018）研究显示，CTGF可诱导脑胶质瘤细胞增殖而发挥其促癌作用。纤维血管膜的形成与视网膜纤维化密切相关，而CTGF是与糖尿病视网膜病变纤维化密切相关的细胞因子（Ma et al.，2018）。Bartanusz和Sayre（2018）研究表明，通过慢病毒介导的CTGF基因沉默可抑制大鼠脊髓损伤模型中神经胶质瘢痕组织的形成。【本研究切入点】虽然目前已有大量研究证实CTGF基因对癌症的发生和发展具有促进或抑制作用，但CTGF在某些癌症发生发展过程中的具体作用及其分子机制尚不明确，仍需进一步探究阐明。近年来，以广西巴马小型猪为动物模型开展相关疾病基因的研究已有报道，其中，陈少梅等（2013）研究报道了广西巴马小型猪Tau基因存在可变剪接体并进行相关鉴定和功能研究，苏秀珍等（2013）对广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）进行相关分析并成功构建其真核表达载体。同理，也可充分利用广西巴马小型猪的物种优势对CTGF基因功能进行研究。【拟解决的关键问题】拟构建广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体并鉴定其活性，为深入研究CTGF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考，也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

广西巴马小型猪由广西大学巴马小型猪封闭养殖场提供;反转录试剂盒、DNA胶回收试剂盒、pMD18-T载体、限制性内切酶和Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;pDsRed-N1载体（4700 bp）和小鼠Hep3B细胞由广西大学动物科学技术学院动物遗传育种实验室保存提供;T4 DNA Ligase购自宝生物工程（大连）有限公司;卡那霉素购自上海华舜生物技术有限公司;无内毒素质粒小提中量试剂盒（E.Z.N.A.® Endo-free plasmid Mini Kit II）购自OMEGA公司;Lipofectamine™ LTX and Plus Rea-gent购自Life Technologies公司;DMEM、Opti-MEM及RPMI1640培养基购自Gibco公司;胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司;二甲基亚砜（DMSO）和0.25%胰蛋白酶购自Sigma公司。

1. 2 引物设计与合成

根据NCBI上已公布的普通猪CTGF基因序列（登录号NM_213833.2），利用Oligo 7.6设计扩增引物（CTGF-F：5'-AAGCTTATGTCCGCCACCGGCC TG-3'和CTGF-R：5'-GGATCCTAGGCCATGTCTCC ATACATC-3'），酶切位点（下划线部分）分别为Hind III和BamH I，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 CTGF基因扩增

采用TRIzol法提取广西巴马小型猪肝组织总RNA，按照反转录试剂盒说明合成cDNA。PCR反应体系15.0 µL：cDNA模板1.0 µL，Taq DNA聚合酶（5 U/mL）7.5 µL，上、下游引物（20 mmol/L）各0.5 µL，ddH2O 5.5 µL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50，进行32个循环;72 ℃延伸7 min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1. 4 pMD18-CTGF重组质粒获取

通过胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，与pMD18-T载体连接后转化DH5α感受态细胞，18 h后挑取菌落进行PCR鉴定，阳性菌落送至深圳华大基因公司测序。测序结果正确，即构建获得pMD18-CTGF重組质粒。

1. 5 pDsRed-CTGF真核表达载体构建

pMD18-CTGF重组质粒与提纯后的pDsRed-N1载体分别用Hind III和BamH I进行双酶切，以1.5%琼脂糖电泳检测后回收酶切产物。经T4 DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞，通过卡那霉素（Kna+）筛选，挑取阳性克隆进行测序鉴定。

1. 6 转染小鼠Hep3B细胞及验证

将小鼠Hep3B细胞成功复苏后传代至6孔板中，当细胞数量达60%～70%时按照Lipofectamine™ LTX and Plus Reagent说明以构建的pDsRed-CTGF真核表达载体对其进行转染。转染48 h后置于倒置显微镜上观察荧光并拍照记录。同时收集细胞，采用TRIzol法提取总RNA后进行实时荧光定量PCR检测。

2 结果与分析

2. 1 广西巴马小型猪CTGF基因扩增结果

以广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板进行RT-PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，约在1050 bp处出现单一明亮的目的条带，与预期结果相符。

2. 2 pDsRed-CTGF真核表达载体构建及验证结果

将pMD18-CTGF重组质粒与pDsRed-N1载体分别用Hind III和BamH I进行双酶切，酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果显示目标条带清晰，其条带大小约为4700和1050 bp，与预期结果相符。分别回收酶切产物（载体骨架和目的片段），然后采用T4 DNA连接酶进行连接并转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆菌去内毒提取pDsRed-CTGF真核表达载体。经Hind III和BamH I双酶切后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果获得两条清晰的目标条带，与预期结果相符。其中一条条带约4700 bp，与载体骨架大小一致，另外一条条带为目的基因片段，约1050 bp。

2. 3 pDsRed-CTGF真核表达载体转染小鼠Hep3B细胞的效果

分别以pDsRed-CTGF真核表达载体和pDsRed-N1载体转染小鼠Hep3B细胞48 h，结果发现二者转染的小鼠Hep3B细胞均能观察到红色荧光，表明pDsRed-CTGF真核表达载体构建成功且能转染小鼠Hep3B细胞。转染48 h后收集小鼠Hep3B细胞进行CTGF基因实时荧光定量PCR检测，结果表明，pDsRed-CTGF转染组小鼠Hep3B细胞中的CTGF基因相对表达量显著高于pDsRed-N1转染组（P<0.05），说明广西巴马小型猪CTGF基因能在小鼠Hep3B细胞中成功表达。

2. 4 广西巴马小型猪CTGF基因测序结果

对阳性pDsRed-CTGF真核表达载体进行测序，结果表明构建获得的真核表达载体中包含广西巴马小型猪CTGF基因的完整编码区（CDS），序列全长1050 bp，共编码349个氨基酸。利用Nucleotide BLAST对测序得到的CTGF基因CDS序列与NCBI上已公布的普通猪CTGF基因CDS序列进行比对，结果发现共有5处碱基发生突变，分别是：第813位C→T，第816位C→T，第825位T→C，第990位C→G，第993位G→T。采用Protein BLAST对CTGF编码氨基酸序列与NCBI上已公布的普通猪CTGF氨基酸序列进行比对，发现5处碱基突变均为同义突变，并未引起氨基酸改变。

2. 5 广西巴马小型猪CTGF基因生物信息学分析结果

2. 5. 1 系统发育进化树 采用Oligo 7.6中的MegAlign对测序获得的广西巴马小型猪CTGF基因CDS序列与NCBI上已公布的其他物种CTGF基因CDS序列进行同源性比对分析，得知广西巴马小型猪与普通猪（Sus scrofa）、人类（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）和鸡（Gallus gallus）的同源性分别为99.5%、91.0%、91.7%、89.0%和84.3%。其中，广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近，其次是牛，亲缘关系最远的是鸡。

2. 5. 2 CTGF蛋白亲/疏水性分析结果 借助ExPASy ProtScale预测CTGF蛋白的亲/疏水性，CTGF蛋白具有较强的亲水性，与ExPASy ProtParam预测得到的总平均疏水分值（GRAVY= -0.189）相符。

2. 5. 3 CTGF蛋白二级和三级结构预测结果 利用NPS@在线蛋白分析系统对广西巴马小型猪CTGF蛋白二级结构进行预测。在广西巴马小型猪CTGF蛋白二级结构中，α-螺旋（以h表示）、β-折叠（以t表示）、氨基酸残基构成的延伸链（以e表示）、无规则卷曲（以c表示）各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。同时利用SWISS-MODEL分析预测广西巴马小型猪CTGF蛋白三级结构，得知广西巴马小型猪CTGF蛋白可能存在的三级结构有5种模型。

3 讨论

CTGF属于新的富含半胱氨酸生长因子家族成员之一，由349个氨基酸组成，在人类的心血管系统、脑组织、骨骼肌、消化道、肾脏和胰腺等组织器官中均有发现，其中含量最高的是肾脏（Wada et al.，2002）。CTGF在机体发育与分化、雌性生殖系统、血管生成（Kubota and Takigawa，2007）、伤口修复（de Winter et al.，2008;Liu et al.，2011）、纤维变性病变（Leask，2009）、炎性病变及肿瘤发生发展（包晶晶等，2013）等多种生物学过程中发挥重要作用。目前，关于CTGF在癌症方面的研究报道较多。Liu等（2008）认为CTGF可作为胃癌前病变、早期诊断和预后判定的指标，而柏秀玉等（2016）认为CTGF可作为卵巢癌新的標志物。CTGF对不同肿瘤具有细胞特异性和环境特异性，在不同肿瘤组织中的表达也不同。此外，有研究报道CTGF有可能成为风湿性心脏病抗纤维化治疗的潜在靶点（Wang et al.，2016）。如在增殖性糖尿病视网膜病变中，CTGF的靶向治疗可能是预防增殖性糖尿病及其他与新血管形成和纤维化相关眼部疾病的新方法（Kuiper et al.，2008）。

本研究从广西巴马小型猪肝脏组织中成功克隆获得CTGF基因CDS序列，通过与NCBI上已公布的普通猪CTGF基因CDS序列进行比对，发现共有5处碱基发生突变，且均为同义突变，说明CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定。广西巴马小型猪CTGF基因CDS序列与NCBI上已公布其他物种CTGF基因CDS序列的同源性分析结果显示，广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近（同源性达99.5%），其次是牛（同源性为91.7%），与人类的同源性也在90.0%以上。广西巴马小型猪的各种生理生化指标及各脏器组织的大小结构与人体极为相似，可作为动物模型用于与人类相关疾病的研究（齐丽娜等，2012;宋少锐等，2014;司景磊等，2016）。本研究结果还表明，广西巴马小型猪CTGF基因在pDsRed-CTGF真核表达载体和pDsRed-N1载体转染的小鼠Hep3B细胞中均有表达，但pDsRed-CTGF转染组小鼠Hep3B细胞中的CTGF基因相对表达量显著高于pDsRed-N1转染组，说明广西巴马小型猪CTGF基因能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达，与吴延军等（2015）的研究结果一致，为生产CTGF转基因广西巴马小型猪提供了技术支持。

目前，有关脏器移植、干细胞、转基因等研究领域发展迅速。国外学者Kragh等（2009）已成功利用手工克隆方法生产出针对阿尔茨海默病的转基因小型猪模型;郝朝亮等（2014）已成功通过体细胞核移植及脂质体转染技术生产出广西巴马小型猪转基因克隆胚胎，为后期生产转基因广西巴马小型猪疾病模型奠定了基础。本研究构建了广西巴马小型猪CTGF基因的真核表达载体，并成功转染小鼠Hep3B细胞，为研究CTGF基因在哺乳动物中的表达规律及其生物学活性打下基础，也为研发治疗由CTGF引发的癌症药物提供参考依据。

4 结论

广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定，通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达，可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型。

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（責任编辑 兰宗宝）