北乌头组培快繁技术体系初步研究

宋子龙 王峰洁 宋彩民

摘要：  本文对北乌头组培快繁技术体系进行了初步研究，同时比较了不同外源激素组合对北乌头外植体诱导的影响，其结果表明：北乌头愈伤组织诱导最佳外植体为叶片，丛生芽诱导最佳外植体为带芽茎段及茎尖，愈伤组织诱导最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D，丛生芽诱导最适合培养基为MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA，继代培养以WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA效果最为显著，增殖率在4倍以上;北乌头生根最佳培养基为1/2MS+0.1 mg/L NAA，生根率可到90%。

关键词：  北乌头;  组织培养;  快速繁殖

北乌头（Aconitum kusnezoffii）为毛茛科多年生草本植物，多分布在我国东北及华北地区。北乌头花大色美，具有较好的观赏价值;块根富含各种乌头碱，具有镇痛、镇痉、祛风湿和解热等作用;从乌头碱中提取出来的双脂型生物碱毒性大，可作为新型的植物性杀虫剂，开发前景广阔[ 1 - 4 ]。目前，北乌头人工栽培少，加上野生资源有限，且产量和质量都较低，因此本文对其进行组织培养技术研究，以期为建立北烏头组织培养技术体系，提供大量的人工苗，为开发新型的植物性杀虫剂和增加观赏花卉种类奠定基础。

1 材料及方法

1. 1 试验材料

秋季采集北乌头块根栽植于花盆中，放在试验室培养，待植株长到20 cm左右时进行试验。

1. 2 试验方法

分别采用不同消毒时间、不同外植体和不同培养基对北乌头组织培养技术体系进行初步研究。

1. 2. 1 最适消毒时间的选择

将茎尖用清水冲洗干净后，置于无菌超净工作台上，然后放置在0.1% HgCl2中进行灭菌，浸泡时间分别为2、4、6、8、10 min，然后用无菌水冲洗4～5次，并反复摇动以彻底洗掉HgCl2，防止对外植体的毒害作用。将消毒过的外植体接种到启动培养基上，每个处理10瓶，2次重复，统计污染率、死亡率及存活率。

1. 2. 2 最佳外植体的选择

选取带芽点块根、嫩芽、茎尖、茎段、叶片和叶柄6种外植体。将带芽点块根清洗干净，去掉外表皮，切成1 cm×1 cm的小块;嫩芽剥掉外皮，清洗干净待用;茎尖、茎段及叶柄剪成1.5～2 cm待用;叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的方块待用;所有外植体灭菌后均接种到MS培养基上，定期观察外植体生长分化情况。

1. 2. 3 启动培养基的筛选

以MS为基本培养基，将灭菌过的外植体接种到MS培养基上，附加不同浓度激素（6-1.0 mg/LBA+   1.0 mg/L2.4-D、2.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D、1.0 mg/L  6-BA+0.2 mg/LNAA、2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA、 1.0 mg/LTDZ+1.0 mg/L2.4-D、2.0 mg/LTDZ+1.0 mg/L 2.4-D、1.0 mg/LTDZ+0.2 mg/LNAA、0.2 mg/LTDZ+  0.2 mg/LNAA），蔗糖为20 g/L，pH为5.8。每瓶接种一个外植体，每个处理25瓶，注意观察记录生长分化情况，从而探索北乌头启动培养基的最佳外源激素组合。

1. 2. 4 继代培养基的筛选

分别以MS、WPM为基本培养基，添加不同浓度的外源激素（表1），蔗糖为20 g/L，琼脂为7 g/L，pH为5.8，探索北乌头继代培养的最佳外源激素组合。

1. 2. 5 生根培养基的筛选

将伸长后的芽苗接种到生根培养基上，以1/2MS为基本培养基，加入不同浓度的（0.1 mg/L、0.3 mg/L）NAA和IBA（0.1 mg/L、0.3 mg/L），比较NAA及IBA对北乌头生根的影响。

1. 3 培养条件

培养室温度（23±1）℃，光照时间10 h/天，光照强度1 500～2 000 lx。

2 结果与分析

2. 1 最适消毒时间的选择

从不同灭菌时间对北乌头灭菌效果的影响（图1）可知：灭菌时间的长短对北乌头外植体有较大的影响。当灭菌时间为2 min时，污染率较高，死亡率和存活率较低;当灭菌时间为10 min时，死亡率较高，污染率和存活率较低;当灭菌时间为6 min时，存活率到达80%;4 min次之，存活率为75%;所以最适消毒时间应选用4～6 min。

2. 2 最佳外植体的选择

由不同外植体的培养情况（表2）可知：在相同培养条件下，各外植体的污染及分化情况各不相同。茎尖及茎段不易发生褐变，叶腋处可以直接产生新芽且分化率较高，适合作为外植体;叶片易形成愈伤组织且长势良好，适合进行下一步培养。

2. 3 启动培养基选择

由不同外源激素组合对外植体诱导的影响（表3）可知：从平均诱导率来看，以MS+1.0 mg/L

6-BA+0.2 mg/LNAA最高，达76%，其小苗健壮，叶片浓绿，分化系数为5，愈伤组织生长良好;其次为MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D，平均诱导率为72%，愈伤组织生长情况最好。细胞分裂素6-BA与TDZ比较来看，以6-BA诱导效果较好，且都是以低浓度的效果为佳;生长素2.4-D对愈伤组织的形成起着至关重要的作用，而NAA对于芽的生长效果较好。

2. 4 继代培养基选择

将初代培养的芽苗及愈伤组织继续培养，综合基本培养基继代情况及初代芽苗生长情况，对分裂素6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）及生长素NAA（0.5、

1.0、2.0 mg/L）、IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）组合进行了再次筛选，其中1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA效果最好;比较了MS与WPM培养基的分化情况（表4）可以看出：愈伤组织及丛生芽分化的情况均以WPM效果较好。因此，北乌头继代培养最佳培养基为WPM+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA，平均增殖率在4倍以上。

2. 5 生根培养

北乌头生根培养基以0.1 mg/LNAA生根效果最佳，10天左右开始生根，平均生根率达到90%，添加IBA的培养基没有生根，这与关文灵等的研究略有不同[ 5 ]。

3 结论与讨论

3. 1 北乌头愈伤组织诱导最佳外植體为叶片，易产生愈伤组织，但褐化现象比较严重，这与林静、何毅对乌头组培快繁的技术研究结果一致[ 6 ]。为了降低褐化率，在诱导初期可缩短转瓶时间，加快转接频率，添加活性炭或抗褐化剂进行抑制[ 7 ]。

3. 2 最佳培养基为MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA，丛生芽诱导以茎段及茎尖较好，在培养基MS+1.0 mg/L6-BA+1.0 mg/L2.4-D，上长势最佳。

3. 3 继代培养以WPM+1.0 mg/L6-BA+0.5 mg/LIBA效果最为显著，平均增殖率在4倍以上。

3. 4 北乌头生根最佳培养基为1/2MS+0.1 mg/LNAA，生根率可到90%。

3. 5 北乌头在培养过程中，褐化现象较为严重，尤其初期诱导时期，可缩短转瓶时间以降低褐化率;诱导时期MS培养基效果较好，但是继代培养效果不如WPM培养基，可能是MS培养基无机盐浓度较高的缘故。

参考文献

[1] 刘丽华，  王双，  关磊.  北乌头乙醇提取液对菜青虫体内保护酶活性的影响[J].  江苏农业科学，  2015，  43（1）：  146 - 147.

[2] 符华林.  我国乌头属药用植物的研究概况[J].  中药材，2004（2）：149～152

[3] 顾地周，  巴春影，  谢艳君.  长白山区3种乌头属植物对3种农作物螟虫触杀活性的比较[J].  农药，  2011，  50（4）：  296 - 299.

[4] 高占林，  潘文亮，  党志红，  等.  几种杀虫植物对蚜虫的生物活性及与化学杀虫剂混用的联合毒力[J].  河北农业大学学报，2004，  27（4）：  67 - 70.

[5] 关文灵，  王黎，  郑思乡.  乌头植株再生体系的建立[J].  中草药，  2003，  34（6）：  561 - 563

[6] 林静，  何毅.  乌头组培快繁的技术探讨[J].  贵州科学1998，  16（2）：  120 - 123.

[7] 瞿素萍，  陈伟，  屈云慧，  等.  组织培养法快速繁殖川乌头种苗[J].  中国野生植物资源，  2004，  23（4）：  62 - 63.