响应面法优化黑变红枣枣皮类黑精细胞破碎和水浴联动提取工艺

时川 高琳 孙欣 张仁堂

摘 要：研究表明，黑变红枣枣皮类黑精的最大吸收波长为280nm，本试验以黑变红枣枣皮为原料，在单因素试验的基础上，通过响应面分析法优化水浴与细胞破碎联动对黑变红枣枣皮类黑精提取工艺并建立回归模型。结果表明：最佳提取工艺条件为水浴时间100min、水浴温度78℃、细胞破碎时间为53min、细胞破碎功率66%。在此工艺条件下，测得黑变红枣枣皮吸光度为1.072。与理论值1.031相比，相对误差约3.9%。与常规水浴法和细胞破碎提取黑变红枣枣皮类黑精相比，联动水浴和细胞破碎提取效果更好。最佳提取级数为3级，提取率为91.38%。

关键词：黑变红枣枣皮;类黑精;响应面法;水浴;细胞破碎;联动;提取率

中国是红枣的原产地，已经有4 000多年的栽种历史，资源十分丰富，年产量达400 t[1]。红枣营养含量丰富，尤其是糖类、矿物质、维生素和氨基酸更是高于苹果、柑橘等常见水果。红枣还具有抗肿瘤、抗衰老、保肝护脾、提高机体免疫力等作用，随着对红枣功能成分与药理的深入研究，红枣还具有富含多糖、环磷酸腺苷、皂貳类物质、黄酮类等具有很高生理活性的特殊的功能成分[2]。目前我国红枣产量连年增长，但红枣产品加工企业大多处于初级阶段，没有高科技高附加值的产品，因此需要继续拓宽红枣深加工领域。

黑变红枣是指将红枣经过控温控湿高温熟化发生美拉德反应而形成的一种枣制品，黑变红枣与未经黑变的红枣相比，5-羟甲基糠醛含量增加，总糖、还原糖、抗坏血酸和氨基酸态氮含量减少[3]。黑变红枣由于其独特的高温熟化工艺，使得黑变红枣富含有美拉德反应产物—类黑精。类黑精是一种结构非常复杂，颜色呈深褐色的糖类与氨基酸等含氮化合物之间发生美拉德反应后期所形成的一种大分子含氮化合物，具有抗氧化活性、促进铁吸收、抑菌、降压等生理作用[4-5]。对于类黑精的提取和功能方面的研究，国际上研究的比较少，有关研究表明，在对食品进行加热处理的过程中产生的类黑精可以显著地改善食品的某些物理性能，如赋予食品颜色、香味和质地同时增加食品的适口性[6-8]。红枣枣皮经美拉德反应黑变后枣皮含有大量的类黑精物质，通过适当的方式将其从原材料中提取出来，才能更好的加以利用。细胞破碎技术是指通过转化化学、物理和生物法破坏细胞释放胞内有机物的技术，以机械破碎为主[9]。水浴提取则是传统的提取目标物的方法，Box-Behnken响应面法是一种优化工艺条件的有效方法，该法不仅可以建立连续变量曲面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行评价，确定最佳水平范围，而且所需的试验组数相对较少，可节省人力物力[10-12]。本文以黑变红枣枣皮为原料，通过细胞破碎与水浴联动提取黑变红枣枣皮类黑精，通过响应面法确定出最佳的提取工艺条件，目的是进一步发掘黑变红枣枣皮的可利用程度，为红枣的综合利用提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 宁阳圆铃枣，泰安市大润发超市。蒸馏水。

1.1.2 仪器 101-2ES 电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂;JYL-C19V 厨房机械料理机;AX1242H 电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司;UV-755B 紫外分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司;VCX150 超声波破碎仪，上海思伯明仪器设备有限公司;HH-6 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 红枣选择宁阳圆铃枣（干枣），将一定量的红枣按一定的比例覆水1h，然后按照比例加水装袋放入烘箱黑变72h，取出黑变红枣将枣肉清洗干净，枣皮放入80℃的烘箱内烘干，粉碎过100目筛，放置于密闭容器中备用。

1.2.2 黑变红枣枣皮类黑精最佳吸收波长的测定 精准称取2g黑变红枣枣皮粉末，无损的转移到烧杯中，加入150mL蒸餾水，在水浴时间30min、水浴温度60℃、细胞破碎时间20min、细胞破碎功率30%的条件下联动提取，过滤备用，取1mL粗提液加蒸馏水适当稀释，取蒸馏水作为空白对照，在200～400nm波长处测定类黑精的吸光度，确定黑变红枣枣皮类黑精的最大吸收波长。

1.2.3 单因素试验

（1）细胞破碎功率对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响：精确称取0.5g黑变红枣枣皮粉末，无损的转移到烧杯中，加入150mL蒸馏水，在细胞破碎时间为10min的条件下，分别考察不同的细胞破碎功率下（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响。

（2）细胞破碎时间对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响：精确称取0.5g黑变红枣枣皮粉末，无损的转移到烧杯中，加入150mL蒸馏水，在细胞破碎功率20%的条件下，分别考察不同的细胞破碎时间下（10、20、30、40、50、60min）对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响。

（3）水浴时间对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响：精确称取0.5g黑变红枣枣皮粉末，无损的转移到烧杯中，加入150mL蒸馏水，在水浴温度50℃的条件下，分别考察不同的水浴时间下（40、50、60、70、80、90、100、110、120min）对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响。

（4）水浴温度对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响：精确称取0.5g黑变红枣枣皮粉末，无损的转移到烧杯中，加入150mL蒸馏水，在水浴时间40min的条件下，分别考察不同水浴温度下（50、60、70、80、90、100℃）对黑变红枣枣皮类黑精提取的影响。

1.2.4 黑变红枣枣皮类黑精提取条件优化 根据Box-Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对黑变红枣枣皮类黑精吸光度值的影响，选取对黑变红枣枣皮类黑精吸光度影响较为显著的水浴时间、水浴温度、细胞破碎时间、细胞破碎功率4个因素，以黑变红枣枣皮类黑精提取液吸光度值为为响应值，建立四因素三水平的试验设计，通过试验确定最优提取工艺。响应面分析因素及水平见表1。

1.2.5 提取率与提取级数的测定 在确定最佳提取条件下，多次的浸提一定量的经粉碎的黑变红枣枣皮，直至浸提液接近于无色，分别收集各次的浸提液并测定其体积Ai与Vi，最后合并各次提取液得到总体积V与总吸光度A，计算各次的提取率，确定提取级数，提取率计算公式为式（1）：

提取率（%）=AiVi/AV×100%（1）

2 结果与分析

2.1 黑变红枣枣皮类黑精最佳吸收波长的测定

由图1可以看出，黑变红枣枣皮类黑精吸收峰在250～300nm之间，本试验确定黑变红枣枣皮类黑精的最佳吸收波长为280nm。

2.2 细胞破碎辅助提取黑变红枣枣皮类黑精的单因素试验结果

2.2.1 细胞破碎功率对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响 由图2可以看出，细胞破碎功率为20%～100%，随着功率的不断增加，黑变红枣枣皮类黑精的吸光度值也随之提高，当功率到达70%时达到峰值，之后黑变红枣枣皮类黑精的吸光度值提高的功率开始减小，对黑变红枣枣皮类黑精吸光度无显著性影响（P<0.05），这是由于功率的不断增加，细胞破碎仪所产生的空化作用所带来的冲击波与局部高温随之增加，对于枣皮破碎的力度不断加大[13]，类黑精的提取效果也随之提高。综合考虑细胞破碎功率对吸光度值的影响，选取60%、70%、80%做响应面分析以确定最佳的提取功率。

2.2.2 细胞破碎时间对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响 由图3可以看出，细胞破碎时间为10～60min，随着时间的不断增加，黑变红枣枣皮类黑精的吸光度值也随之提高，当时间达到50min時达到峰值，显著高于其他时间的吸光度（P<0.05），之后黑变红枣枣皮类黑精的吸光度值提高的幅度开始减小，吸光度值降低，可能由于随着细胞破碎时间的延长，细胞破碎仪所产生的超声波具有强大的机械剪切作用，长时间的作用下使得类黑精结构里高分子化合物结构破坏[14]，使得吸光度值下降，而且长时间的细胞破碎还会造成大量杂质成分的溶出，综合考虑细胞破碎时间对吸光度值的影响，选取40、50、60min做响应面分析以确定最佳的提取时间。

2.3 水浴辅助提取黑变红枣枣皮类黑精的单因素试验结果

2.3.1 水浴时间对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响 由图4可以看出，水浴的时间为40～120min，随着水浴时间的不但增加，黑变红枣枣皮类黑精的吸光度值呈先上升后下降的趋势，当水浴时间到达100min时达到最大值，显著高于其他时间的吸光度（P<0.05），并且在100min后形成拐点，吸光度值下降，这是由于随着水浴时间的增加，黑变红枣枣皮里面的类黑精得到充分溶解，吸光度值增大。当水浴时间达到100min时达到最大值后随着时间延长，杂质含量增多，有效成分下降，也可能由于溶出的类黑精随着时间延长而发生降解[15]。综合考虑水浴时间，选取80、10、120min做响应面分析以确定最佳水浴提取时间。

2.3.2 水浴温度对黑变红枣枣皮类黑精提取效果的影响 由图5可以看出，在水浴温度在50～80℃之间，黑变红枣枣皮类黑精的吸光度随温度的增大而显著增加（P<0.05）。继续增加温度，吸光度无显著性差异（P> 0.05），这是由于随着水浴温度的不断增加，分子热运动加剧，分子的扩散速度也随之加快，使得黑变红枣枣皮里面的类黑精加速进入水中，使得吸光度不断增加[16]。综合考虑水浴温度，选取70、80、90℃做响应面分析以确定最佳水浴提取温度。

2.4 细胞破碎水浴联动提取黑变红枣枣皮类黑精的响应面优化试验结果

2.4.1 响应模型的建立与分析 在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对黑变红枣枣皮提取效果的影响，依据Box-Behnken试验设计原理，通过响应面法对水浴时间、水浴温度、细胞破碎功率、细胞破碎时间4个因素分析得到试验方案和结果。对表2中的数据进行多元回归拟合，获得黑变红枣枣皮类黑精对编码自变量水浴时间、水浴温度、细胞破碎时间、细胞破碎功率的二次多项回归方程：吸光度=-26.86+0.018A+0.015B+0.048C-0.084D- 003AB-003AC+0.013AD-0.024BC+0.048BD-0.023CD-0.08A 2-0.045B 2-0.097C 2-0.1D 2

表3方差分析可以看出，P模型<0.000 1，表明回归模型极显著;黑变红枣枣皮类黑精吸光度失拟项P=0.588 6，表明失拟不显著，所选用的二次回归模型是适当的;试验模型的决定系数R 2=92.69%，说明黑变红枣枣皮类黑精吸光度的结果与模型预测结果有着良好的一致性，试验模型的校正系数R 2Adj=85.38%，说明试验结果有85.38%受试验因素的影响，因此，结果可靠，此模型可以对结果进行分析和预测。回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响，一次项中C和D即细胞破碎时间与细胞破碎功率的影响极为显著，交互项中BD的影响显著，说明水浴温度与细胞破碎功率对黑变红枣枣皮类黑精吸光度的影响显著，二次项中A 2、B 2、C 2、D 2的影响都极为显著。各个因素对黑变红枣枣皮类黑精吸光度影响的大小顺序为：D（细胞破碎功率）>C（细胞 破碎时间）>A（水浴时间）>B（水浴温度）。

2.4.2 黑变红枣枣皮类黑精的响应面分析 利用Design-Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行二次多元回归拟合。如图6所示，响应面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件的改变越敏感，该因素对黑变红枣枣皮类黑精吸光度值影响越大;反之则表明因素对吸光度的影响越小。等高线图反映了存在极值的条件在圆心处。在交互项对吸光度的影响中，水浴温度和细胞破碎时间交互作用明显，其他因素之间交互作用不明显，这与方差分析的结果一致。

2.4.3 确定最佳提取条件与验证回归模型 通过响应面法得到黑变红枣枣皮类黑精最佳提取工艺参数为水浴时间101.24min、水浴温度78.17℃、细胞破碎时间为53.25min、细胞破碎功率为65.05%，此工艺条件下黑变红枣枣皮类黑精理论吸光度值为1.031，实际操作过程中调整工艺参数为水浴时间10min、水浴温度78℃、细胞破碎时间53min、细胞破碎功率66%，在此条件下进行验证试验，得到类黑精吸光度平均值为1.072，其相对误差约为3.9%，说明回归方程模型比较可靠，具有一定的实践指导意义。

2.5 提取级数的确定

在确定最佳提取黑变红枣枣皮类黑精工艺条件下，多次的浸提一定量的枣皮，按照1.2.4中的方法计算计算提取率。通过表4可以看出，随着提取次数的增加，提取效率也随之增加，2次提取的提取率为80.75%，3次提取的提取率为91.38%，可以看出3次提取就可以提取出黑变枣皮中的大多数类黑精，所以选择3次提取作为最佳提取级数。

3 讨论

细胞破碎仪是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。通过联动水浴与细胞破碎提取黑变红枣枣皮类黑精，相比单一法提取类黑精其提取的吸光度值明显更高，更能将类黑精从黑变红枣枣皮中提取出来。但是细胞破碎单次破碎红枣枣皮量有限制，对以后大批量提取破碎提取黑变红枣枣皮类黑精有一定的影响，如何对黑变红枣进行大批量细胞破碎提取类黑精是将来试验研究的重点。

4 结论

本试验以宁阳圆铃枣为原料，采用聯动水浴细胞破碎辅助提取黑变红枣枣皮类黑精，并且通过响应面法优化了黑变红枣枣皮类黑精提取工艺，联动水浴细胞破碎提取黑变红枣枣皮类黑精的最佳提取工艺为水浴时间101min、水浴温度78℃、细胞破碎时间53min、细胞破碎功率66%，在此条件下进行验证试验测得类黑精的吸光度为1.072，与预测值的吸光度1.031相对误差为3.9%，拟合良好，在此条件下最佳提取级数为3级，提取率为91.38%。◇

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Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction and Combined Water Bath and Cell Disruption of Blacken Jujube Peel Melanoidin

SHI Chuan，GAO Lin，SUN Xin，ZHANG Ren-tang

（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China）

Abstract：Study shows that the maximum absorption wavelength of melanin in blacken jujube peel melanoidin is 280nm.With black jujube peel as raw material，on the basis of single factor experiment，response surface methodology was used to optimize the extraction process of melanosperm from blacken jujube peel melanoidin by linkage water bath and cell breakage and establish regression model.The results showed that the optimum extraction conditions were water bath time of 100min，water bath temperature 78℃，cell fragmentation time of 53min，and cell fragmentation amplitude of 66%.Under this technological condition，the absorbance of black jujube peel was 1.072.Compared with the theoretical value of 1.031，the relative error was about 3.9%.Compared with the conventional water bath method and cell crushing method，the combined water bath and cell crushing extraction effect were better.The optimum extraction stage was 3 and the extraction rate was 91.38%.

Keywords：blacken jujube peel;melanoidin;response surface methold;water bath;cell disruption;linkage;extraction efficiency

（責任编辑 唐建敏）