膀胱癌组织中细胞周期检测点激酶2的表达及其意义

井岗山 张哲

[摘要]目的 探讨细胞周期检测点激酶2（CHK2）在膀胱癌组织中表达及临床意义。方法 分别采用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学法，检测73例膀胱癌及癌旁组织中CHK2基因和蛋白的表达情况。结果 膀胱癌组织中CHK2 mRNA相对表达量低于癌旁组织，膀胱癌组织中CHK2蛋白阳性表达率低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=24.146，χ2=49.936，P<0.05）;膀胱癌组织中CHK2 mRNA相对表达量和CHK2蛋白阳性表达均与pT分期、淋巴结转移和P53蛋白表达有关（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）;CHK2蛋白阴性表达组病人平均生存时间47.25个月，CHK2蛋白阳性表达组病人平均生存时间67.24个月，Log-Rank检验差异有统计学意义（χ2=4.269，P<0.05）。結论 CHK2在膀胱癌组织中呈低表达，且与病人预后有关。

[关键词]膀胱肿瘤;细胞周期检测点激酶2;病理学，临床

[中图分类号]R737.14;R365

[文献标志码]A

[文章编号] 2096-5532（2019）05-0510-04

doi：10.11712/jms201905002

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

膀胱癌作为泌尿系统常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年升高的趋势，由于膀胱癌多呈浸润性生长，术后具有较高的复发率[1]，严重威胁人类的健康。研究表明，细胞周期异常在肿瘤发生、进展和转移中发挥重要作用[2]。细胞周期检测点激酶2（CHK2）是调控细胞周期的主要激酶之一，与细胞周期稳定、DNA修复、基因组平衡等密切相关[3-5]。CHK2参与了多种恶性肿瘤发生及进展过程[6]。实验研究结果显示，RPA介导的膀胱癌TSGH-8301细胞生长抑制与CHK2激活相关[7]。但CHK2与膀胱癌临床病理特征及病人预后间的关系鲜有报道。本研究对膀胱癌组织中CHK2基因及蛋白表达进行检测，探讨其与临床病理特征之间的相关性及对预后的影响。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年3月-2012年3月，我院收治的膀胱癌病人73例，术前均未行放化疗，术后经病理活检证实为原发性尿路上皮性癌。73例病人，男性62例，女性11例;年龄28～81岁，平均年龄（61.7±11.4）岁。均于术中留取膀胱癌组织及癌旁组织（距肿瘤边缘>2 cm），组织标本分两份，其中1份用40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋;另1份快速置于液氮中，保存于-70 ℃冰箱以备检。本研究通过医院伦理委员会批准，所有病人均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量PCR技术检测膀胱癌及癌旁组织中CHK2基因表达 分别取膀胱癌及癌旁组织，研磨，用Trizol总RNA提取试剂盒（购自美国Gibco公司）提取组织细胞中总RNA。利用紫外线分光光度计检测总RNA纯度和浓度，以A260/A2801.80～2.20作为合格。用逆转录试剂盒（购自大连宝生物公司）逆转录，用PCR试剂盒（购自日本TaKaRa公司）进行扩增。引物种类及其序列见表1。PCR反应条件：94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，72 ℃、6 min，连续进行36次循环。每个样品均设3个平行反应复孔。用2-△△Ct法计算膀胱癌及癌旁组织中CHK2基因相对表达量。

1.2.2 免疫组化染色检测膀胱癌及癌旁组织中CHK2蛋白表达 取石蜡包埋组织标本，切片，常规脱蜡、水化，进行抗原修复，用体积分数为0.03的过氧化氢溶液封闭，山羊血清封闭25 min。加入一抗兔抗人CHK2多克隆抗体（购自武汉博士德公司，稀释比例1∶200），4 ℃下过夜孵育。加入二抗，室温下孵育60 min，加入DAB，苏木精复染，脱水、封片，观察。用双盲法分别由两位具有副高级以上职称医师观察，按照文献的方法[8]判定结果。①染色范围：0分，无染色;1分，阳性染色细胞比例<25%;2分，阳性染色细胞比例26%～50%;3分，阳性染色细胞比例51%～75%;4分，阳性染色细胞比例>75%。②染色强度：0分，无着色;1分，染色浅黄色;2分，染色黄色或棕色;3分，染色棕褐色。③染色指数：取①+②之和，0级，≤2分;1级，3～4分;2级，5～6分;3级，7分。根据染色指数对结果进行判定：阴性，0级或1级;阳性，2级或3级。

1.2.3 病例随访 所有病人均进行随访，随访形式包括门诊和电话，随访截止日期2017年3月31日，随访过程中未出现失访病例。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计分析软件完成数据整理和分析。计量资料采用[AKx-D]±s表示，组间比较采用t检验;计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验;生存分析采用Kaplan-Meier法，生存曲线比较采用Log-Rank检验。以P<0.05为差异有显著意义。

2 结果

2.1 膀胱癌及癌旁组织CHK2基因和蛋白表达的比较

膀胱癌组织中CHK2 mRNA相对表达量明显低于癌旁组织，差异有统计学意义（t=24.146，P<0.05）。膀胱癌组织中CHK2蛋白的阳性表达率低于癌旁组织，差异具有统计学意义（χ2=49.93，P<0.05）。见表2和图1。

2.2 膀胱癌组织CHK2基因和蛋白表达与临床病理特征之间的关系

膀胱癌组织中CHK2 mRNA的相对表达量和CHK2蛋白阳性表达均与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数量和分级无关（t=0.239～1.182，χ2=0.066～1.003，P>0.05），而与pT分期、淋巴结转移和P53蛋白的表达有关（t=2.347～9.217，χ2=4.171～33.400，P<0.05）。见表3。

2.3 膀胱癌組织中CHK2蛋白表达对病人预后的影响

本文73例膀胱癌病人中，截至2017年3月31日，最短生存时间5个月，最长84个月。CHK2蛋白阴性表达组病人的平均生存时间为47.25个月，而阳性表达组病人的平均生存时间为67.24个月，Log-Rank检验显示差异有统计学意义（χ2=4.269，P<0.05）。见图2。

3 讨论

膀胱癌作为一种男性高发恶性肿瘤，发病过程较为复杂，涉及多因素、多步骤[9-11]，其中，细胞周期调控异常在肿瘤发生、进展中发挥关键性作用[12-14]。CHK2是一种细胞周期检查点激酶，在DNA损伤诱导的细胞周期阻滞、细胞凋亡、染色体组装及稳定中发挥重要作用[15-17]。有研究表明，CHK2表达异常会影响细胞周期及细胞修复而导致癌变风险增加[18-20]。CHK2在肿瘤发生中的作用尚存在争议，CHK2在乳癌[21]、肺癌[22]、结直肠癌[23]等恶性肿瘤中表达缺失，可能发挥抑癌基因的作用;但CHK2在胃癌、食管癌、肝癌等恶性肿瘤中表达上调[24-26]，可能发挥癌基因的作用。本研究显示，CHK2在膀胱癌组织中呈低表达，提示CHK2可能在膀胱癌发生中发挥抑制作用。

本研究结果显示，CHK2 mRNA相对表达量和CHK2蛋白阳性表达在pT分期T2～T4期、发生淋巴结转移、P53蛋白阳性的膀胱癌组织中呈低表达，进一步说明CHK2低表达可促进膀胱癌进展，提示CHK2可能充当抑制肿瘤发生的角色而参与膀胱癌发生、进展过程。有研究指出，抑癌基因p53是DNA损伤反应中CHK2关键性作用靶点，CHK2在保证p53稳定及积累中发挥重要作用[27]。p53是一种抑癌基因，但经免疫组化检测到的均为突变型p53，因此与文献[27]不同，突变型p53对CHK2有负反馈调节作用[28]。本研究显示P53蛋白阳性表达的膀胱癌组织中CHK2呈低表达，也从另一个方面说明CHK2高表达对维持P53蛋白稳定发挥重要作用。本研究结果显示，CHK2蛋白阴性表达组病人平均生存时间短于阳性表达组，表明CHK2蛋白表达与膀胱癌病人预后有关，CHK2高表达可能预示着病人预后较好。

综上所述，CHK2在膀胱癌组织中呈低表达，可能由于其发挥抑制肿瘤发生的作用而参与膀胱癌发生、进展过程，且与病人预后相关，有望为膀胱癌诊疗提供新的靶位和思路。

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（本文编辑 牛兆山 于国艺）