LC—MS/MS法同时测定艾司奥美拉唑钠原料药及其制剂中3种杂质的含量

2019-09-10刘克锋刘宇王雪芹赵杰

中国药房 2019年6期

刘克锋刘宇王雪芹赵杰

摘要目的：建立同時测定艾司奥美拉唑钠原料药及其制剂中杂质E、杂质Ⅰ和杂质Ⅳ含量的方法。方法：采用液相色谱-串联质谱法。色谱柱为Agela VenusiL MP C18，流动相为乙腈-水（梯度洗脱），流速为0.2 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为1 μL；离子源为电喷雾离子源，检测方式为负离子模式，工作模式为多反应监测模式，用于定量分析的离子对分别为m/z 360.1→194.0（杂质E）、m/z 375.8→210.7（杂质Ⅰ）、m/z 330.2→312.1（杂质Ⅳ）。结果：杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ检测质量浓度的线性范围分别为0.001 26～0.044 80 μg/mL（r=0.994 7）、0.001 34～0.045 2 μg/mL（r=0.992 8）、0.018 9～1.260 00 μg/mL（r=0.991 4）；定量限分别为0.001 26、0.001 34、 0.018 9 μg/mL，检测限分别为0.000 41、0.000 44、0.006 3 μg/mL；精密度、重复性试验的RSD均小于4%，稳定性试验杂质E、杂质Ⅰ的RSD<10%（n=5），杂质Ⅳ的RSD>15%（n=7）；加样回收率分别为87.69%～100.72%（RSD=4.29%，n=9）、90.04%～100.63%（RSD=3.67%，n=9）、93.58%～101.86%（RSD=2.66%，n=9）。结论：该方法准确、快速、灵敏、专属性强，可用于同时测定艾司奥美拉唑钠原料药及其制剂中3种杂质的含量。

关键词艾司奥美拉唑钠；杂质E；杂质Ⅰ；杂质Ⅳ；液相色谱-串联质谱法；含量测定

Simultaneous Determination of 3 Impurities in Crude Drug and Preparation of Esomeprazole Sodium by LC-MS/MS

LIU Kefeng1，LIU Yu1，WANG Xueqin2，ZHAO Jie1（1. Dept. of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450002， China； 2. Henan Provincial Institute for Food and Drug Control， Zhengzhou 450003， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of impurity E， impurity Ⅰ and impurity Ⅳ in crude drug and preparation of esomeprazole sodium. METHODS： LC-MS/MS method was adopted. The separation was performed on Agela VenusiL MP C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 0.2 mL/min. The column temperature was 35 ℃， and the sample size was 1 μL； analytes were analyzed by electro-spray ionization （ESI） in the multiple reaction monitoring mode， negative ion. The precursors of production transitions m/z 360.1→194.0 （impurity E）， m/z 375.8→210.7 （impurity Ⅰ）， m/z 330.2→312.1 （impurity Ⅳ） were used to measure impurity. RESULTS： The linear range of impurity E， impurity Ⅰ and impurity Ⅳ were 0.001 26-0.044 80 μg/mL （r=0.994 7）， 0.001 34-0.045 2 μg/mL （r=0.992 8） and 0.018 9-1.260 00 μg/mL （r=0.991 4）. The limit of quantitation were 0.001 26， 0.001 34， 0.018 9 μg/mL； the detection limits were 0.000 41， 0.000 44， 0.006 3 μg/mL. RSDs of precision and reproducibility tests were all lower than 4%； RSDs of stability tests of impurity E and impurity Ⅰ were all lower than 10%（n=5）， and that of impurity Ⅳ was higher than 15% （n=7）. The average recoveries were 87.69%-100.72% （RSD=4.29%， n=9）， 90.04%-100.63%（RSD=3.67%，n=9）and 93.58%-101.86%（RSD=2.66%，n=9）. CONCLUSIONS： The method is accurate， rapid， sensitive， selective and suitable for the content determination of 3 impurities in crude drug and preparation of esomeprazole sodium.

KEYWORDS Esomeprazole sodium； Impurity E； Impurity Ⅰ； Impurity Ⅳ； LC-MS/MS； Content determination

质子泵抑制剂艾司奥美拉唑（Esomeprazole）为奥美拉唑的S-异构体，是质子泵抑制剂家族中第一个单一光学异构体。该药可用于糜烂性反流性食管炎、已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗、胃溃疡、十二指肠溃疡，其与抗菌药物联用可根除幽门螺杆菌及愈合十二指肠溃疡、防止溃疡复发[1-2]。

艾司奥美拉唑在工艺生产及贮存过程中可产生3个杂质：奥美拉唑氮氧化物（杂质E），化学名为5-甲氧基-2{[（4-甲氧基-3，5-二甲基-2-吡啶基）甲基]磺酰基}-1H-苯并咪唑；奥美拉唑砜氮氧化物（杂质Ⅰ），化学名为6-甲氧基-2-{[（4-甲氧基-3，5-二甲基-1-氧代-2-吡啶基）甲基]磺酰基}-1H-苯并咪唑；H215（杂质Ⅳ），化学名为2-{[（5-甲氧基-1H-苯并咪唑-2-基）亚硫酰基]甲基}-3，5-二甲基-4（1H）-1-吡啶酮；其中杂质E、杂质Ⅰ为基因毒性杂质，杂质Ⅳ稳定性较差；2015年版《中国药典》（二部）[3]中有关物质检查项中所列杂质中未包含杂质E和杂质Ⅰ。目前，有关物质检查常用方法为高效液相色谱法[3]，但该方法分析时间较长，灵敏度有限，不能满足毒性杂质和稳定性较差杂质的检查要求。为此，笔者根据《化学药物杂质研究技术指导原则》[4]、人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）相关规定[5-6]，并参考有关文献[7-12]，建立了同时测定艾司奥美拉唑钠原料药及其制剂中杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ含量的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），旨在为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-30A型液相色谱仪，包括LC-30AD泵、SIL-30AC进样器、CTO-30A柱温箱（日本Shimadzu公司）；AB Sciex4500型三重四极杆串联质谱仪，包括电喷雾离子源、Analyst 1.6.3色谱工作站（美国AB公司）；XR 205 SM-DR型电子天平（瑞士Precisa公司）；移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 药品与试剂

杂质E对照品（英国LGC公司，批号：57290，纯度：99.50%）；杂质Ⅰ对照品（济南蔚然生物科技有限公司，批号：WR-2017-601，纯度：98.79%）；杂质Ⅳ对照品（美国CATO公司，批号：10C-11-7，纯度：96.41%）；艾司奥美拉唑钠原料药（天方药业有限公司，批号：17090801x 、17090802x 、17090803x，纯度均为100%）；注射用艾司奥美拉唑钠（美国Nexium公司，批号：PBTB，规格：40 mg）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件色谱柱：Agela VenusiL MP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流动相：水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3.0 min，45%A→30%A；3.0～4.0 min，30%A；4.0～6.0 min，30%A→10%A；6.0～6.1 min，10%A→45%A；6.1～8.0 min，45%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。

2.1.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源；检测方式：负离子模式；工作模式：多反应监测模式；气帘气：25 psi；离子喷雾电压：-5 500 V；温度：450 ℃；雾化气：55 psi；辅助气：55 psi；用于定量分析的离子对分别为m/z 360.1→194.0（杂质E）、m/z 375.8→210.7（杂质Ⅰ）、m/z 330.2→312.1（杂质Ⅳ），解簇电压分别为-13.85、 -16.68、-13.38 V。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液精密称取艾司奥美拉唑原料药、杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加30%乙腈溶解并定容，制成艾司奥美拉唑钠、杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ质量浓度分别为1、0.037 5、0.037 5、1.0 mg/mL的单一贮备液。分别取上述各单一贮备液适量，分别置于10 mL量瓶中，加30%乙腈稀释并定容，制成艾司奥美拉唑钠、杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ质量浓度分别为1、0.037 5、0.037 5、1.0 μg/mL的艾司奥美拉唑钠及各单一杂质对照品溶液。取上述各单一杂质贮备液适量，置于同一10 mL量瓶中，加30%乙腈稀释并定容，即得杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ质量浓度分别为0.037 5、0.037 5、1.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液精密称取注射用艾司奥美拉唑钠10 mg，置于10 mL量瓶中，加30%乙腈溶解并定容，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3 空白溶液以30%乙腈为空白溶液。

2.3 专属性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、空白溶液各1 μL，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，记录色谱图，详见图1。由图1可知，艾司奥美拉唑钠、杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ色谱峰出峰时间分别为4.45、3.00、3.62、2.18 min，空白溶液在相应位置未见色谱峰出现，对测定无干扰。

2.4 线性关系考察

取“2.2.1”项下各单一杂质贮备液适量，分别用30%乙腈稀释，制成杂质E质量浓度分别为0.001 26、0.017 9、0.029 1、0.038 1、0.044 80 μg/mL，雜质Ⅰ质量浓度分别为0.001 34、0.022 6、0.029 4、0.038 42、0.045 2 μg/mL，杂质Ⅳ质量浓度分别为0.018 9、0.525 0、0.840 0、1.050 0、1.260 0 μg/mL的线性关系工作溶液，按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下各单一杂质对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1” 项下色谱与质谱条件进样测定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果，杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ的定量限分别为0.001 26、 0.001 34、0.018 9 μg/mL，检测限分别为0.000 41、0.000 44、0.006 3 μg/mL。

2.6 精密度試验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液（杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ质量浓度分别为0.037 5 、0.037 5、1.0 μg/mL）适量，按“2.1” 项下色谱与质谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ峰面积的RSD分别为3.84%、3.94%、3.03%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：17090801x）适量，分别于室温下放置0、1、2、3、4 h时按“2.1” 项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ峰面积的RSD分别为6.60%、6.40%、16.40%（n=5）。另取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：17090801x）适量，分别于冷藏条件下放置0、1、2、3、4、5、6 h时按“2.1” 项下试验条件进样测定，记录峰面积。结果，杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ峰面积的RSD分别为6.51%、8.40%、21.62%（n=7）。表明，杂质E和杂质Ⅰ在室温下放置4 h和冷藏下放置6 h稳定性较好，杂质Ⅳ在2种条件下均在放置1 h后峰面积明显减小，且随放置时间延长峰面积明显下降，提示杂质Ⅳ的稳定性较差，溶液应临用新制。

2.8 重复性试验

取样品（批号：17090801x）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下试验条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品中各杂质的含量。结果，杂质E、杂质Ⅰ、杂质Ⅳ的平均含量分别为 0.000 84%、0.000 22%、0.002 68%，RSD分别为2.24%、3.40%、1.80%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取已准确测定杂质含量的样品（批号：17090801x），共9份，每份约50 mg，分别置于50 mL量瓶中，加入一定量的单一杂质对照品溶液适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，记录峰面积并以外标法计算加样回收率，结果见表2。

2.10 耐用性试验

2.10.1 色谱柱考察取样品（批号：17090801x）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件[色谱柱分别为Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Agela VenusiL MP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）、Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）]进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品含量，结果见表3。结果表明，当色谱柱发生一定程度变化时，本方法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.10.2 流动相考察取样品（批号：17090801x）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件[流动相分别为水-乙腈（梯度洗脱）、0.01 mol/L醋酸铵-乙腈（梯度洗脱）、0.05 mol/L醋酸铵-乙腈（梯度洗脱）]进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品含量，结果见表3。结果表明，当流动相一定程度波动时，本方法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.10.3 流速考察取样品（批号：17090801x）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件（流速0.15、0.20、0.25 mL/min）进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品含量，结果见表3。结果表明，当流速一定程度波动时，本方法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.10.4 柱温考察取样品（批号：17090801x）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件（柱温30、35、40 ℃）进样测定，记录峰面积并以外标法计算样品含量，结果见表2。结果表明，当柱温一定程度波动时，本方法能满足试验要求，提示其耐用性良好。

2.11 样品中杂质含量测定

取4批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱与质谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积并以外标法计算样品中杂质的含量，结果见表4{表中，“*”表示现行质量标准[2015年版《中国药典》（二部）]规定杂质Ⅳ的限度为1.3%）}。

3 讨论

杂质Ⅳ为降解氧化产物，该杂质易吸潮，吸潮后极易变质，在溶液中稳定性较差，用常规的高效液相色谱法进行有关物质检查耗时较长（大约1 h以上，不同色谱柱略有差异）、重复性较差，加之杂质E和杂质Ⅰ在艾司奥美拉唑钠样品中的含量较低[13-16]，因此常规的高效液相色谱法的灵敏度不能满足试验要求，不能准确地检测和控制样品的含量，故采用LC-MS/MS法测定杂质E、杂质Ⅰ和杂质Ⅳ的含量。

杂质E为奥美拉唑氮氧化物，杂质Ⅰ为奥美拉唑砜氮氧化物，2015年版《中国药典》（二部）未对二者进行控制，目前也尚未有文献报道含量测定的方法。由于杂质E和杂质Ⅰ的分子结构中均含有N→O，故二者均具有一定的潜在基因毒性[4-6]。按照ICH指导原则，对具有基因毒性的杂质应严格控制，且要求杂质E和杂质Ⅰ的含量均不得超过0.003 75%，同时规定杂质Ⅳ的含量不得超过0.1%[5-6]。3种杂质均能在样品中检出，提示本研究所建立的方法可行。样品中杂质E、杂质Ⅰ为基因毒性杂质，两者含量均远远低于限值规定，在正常服用量时不会对人体产生影响。

合适的分析方法能准确地分辨与测定有毒杂质的含量，并综合药学、毒理学研究结果将其限度控制在一个安全、合理的范围内，以保证药品的质量及安全性[17]。由于3个杂质与艾司奥美拉唑钠主成分的极性差别较大，且3个杂质检测模式均采用负离子模式，而主成分采用正离子模式检测（梯度洗脱），使得主成分在所有杂质之后出峰。本研究中，无论是室温还是在低温条件下，杂质E和杂质Ⅰ的稳定性均较好，杂质Ⅳ在放置1 h后峰面积明显下降，稳定性较差，提示样品溶液应临用新制。

综上所述，该方法准确、快速、灵敏、专属性强，可用于同时测定艾司奥美拉唑钠原料药及其制剂中杂质E、杂质Ⅰ和杂质Ⅳ的含量。

参考文献

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