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HPLC法同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量

2019-09-10韩真真邵长森张元元王绍花刘莉林桂涛盛华刚

中国药房 2019年6期
关键词:桂皮内酯桂枝

韩真真 邵长森 张元元 王绍花 刘莉 林桂涛 盛华刚

摘 要 目的:建立同时测定桂枝加芍药汤中芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚含量的方法。方法:采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18,流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(梯度洗脱),流速为1.0 mL/min,检测波长为235 nm(0~35 min,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷)、280 nm(35~65 min,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚),柱温为25 ℃,进样量为20 μL。结果:芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚检测质量浓度线性范围分别为2.125~34.000 μg/mL(r=0.999 9)、28.700~459.200 μg/mL(r=0.999 7)、3.675~58.800 μg/mL(r=0.999 7)、1.235~19.760 μg/mL(r=0.999 8)、2.300~36.800 μg/mL(r=0.999 8)、0.955~15.280 μg/mL(r=0.999 7)、36.000~576.000 μg/mL(r=0.999 7)、1.500~24.000 μg/mL(r=0.999 7);定量限分別为0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL,检测限分别为0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL;精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%(n=6);加样回收率分别为97.47%~100.76%(RSD=1.33%,n=6)、98.15%~103.50%(RSD=1.82%,n=6)、95.65%~100.84%(RSD=2.38%,n=6)、96.75%~100.32%(RSD=1.31%,n=6)、95.88%~102.75%(RSD=2.52%,n=6)、95.63%~100.63%(RSD=2.00%,n=6)、96.78%~100.45%(RSD=1.35%,n=6)、95.71%~100.48%(RSD=1.80%,n=6)。结论:该方法准确、可靠,专属性好,可用于同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量。

关键词 桂枝加芍药汤;高效液相色谱法;含量测定;芍药内酯苷;芍药苷;甘草苷;甘草素;肉桂酸;桂皮醛;甘草酸铵;6-姜酚

Simultaneous Determination of 8 Ingredients in Guizhijiashaoyao Decoction by HPLC

HAN Zhenzhen,SHAO Changsen,ZHANG Yuanyuan,WANG Shaohua,LIU Li, LIN Guitao,SHENG Huagang(College of Pharmacy, Shandong University of TCM, Jinan 250355, China)

ABSTRACT OBJECTIVE: To establish a method for simultaneous determination of albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol in Guizhijiashaoyao decoction. METHODS: HPLC method was adopted. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (gradient elution) at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were 235 nm(0-35 min,albiflorin, paeoniflorin, liquiritin)、280 nm(35-65 min,liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol). The column temperature was 25 ℃, and the sample size was 20 μL. RESULTS: The linear range of albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, liquiritigenin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, ammonium glycyrrhetate and 6-ginger phenol were 2.125-34.000 μg/mL(r=0.999 9), 28.700-459.200 μg/mL(r=0.999 7), 3.675-58.800 μg/mL(r=0.999 7), 1.235-19.760 μg/mL(r=0.999 8), 2.300-36.800 μg/mL(r=0.999 8), 0.955-15.280 μg/mL(r=0.999 7), 36.000-576.000 μg/mL(r=0.999 7) and 1.500-24.000 μg/mL(r=0.999 7), respectively. The quantitative limits were 0.135, 0.102, 0.096, 0.033, 0.013, 0.023, 0.663, 0.198 μg/mL; the detection limits were 0.041, 0.031, 0.029, 0.010, 0.004, 0.007, 0.201, 0.059 μg/mL. RSDs of precision, stability and reproducibility tests were all lower than 3% (n=6). The recovery rates were 97.47%-100.76%(RSD=1.33%,n=6), 98.15%-103.50%(RSD=1.82%,n=6), 95.65%-100.84%(RSD=2.38%,n=6), 96.75%-100.32%(RSD=1.31%,n=6), 95.88%-102.75%(RSD=2.52%,n=6), 95.63%-100.63%(RSD=2.00%,n=6), 96.78%-100.45%(RSD=1.35%,n=6), 95.71%-100.48%(RSD=1.80%,n=6). CONCLUSIONS: The method is accurate, reliable and exclusive, and suitable for simultaneous determination of 8 ingredients in Guizhijiashaoyao decoction.

KEYWORDS Guizhijiashaoyao decoction; HPLC; Content determination; Albiflorin; Paeoniflorin; Liquiritin; Liquiritigenin; Cinnamic acid; Cinnamaldehyde; Ammonium glycyrrhetate; 6-ginger phenol

桂枝加芍药汤出自《伤寒论》:“本太阳病,医反下之,因尔腹满时痛者,属太阴也”。桂枝加芍药汤由桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大枣等5味中药组成,具有调和营卫、理脾和中、缓急止痛的功效[1],临床常用于治疗月经痛、胃痛、腹痛、胃肠痉挛、慢性痢疾等症[2-5]。有研究发现,桂枝汤中的桂皮醛、肉桂酸、芍药苷、甘草酸等均具有抗炎、抗菌、抗病毒、镇痛的作用[6-7]。桂皮醛是桂枝中主要的挥发油成分,具有镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤等作用;肉桂酸是桂枝中主要的有機酸类成分,具有杀菌、止血、抗肿瘤等作用[8]。芍药苷为赤芍的主要成分,芍药内酯苷为芍药苷的同分异构体,均具有镇痛、镇静、解痉及免疫调节的作用[9]。炙甘草中的甘草苷可用于治疗咽炎、急、慢性咳嗽,具有抗抑郁、神经保护等作用; 甘草素是炙甘草中含量较高的黄酮类成分之一,为甘草苷的苷元,具有保肝的作用;甘草酸是炙甘草的主要成分,可在体内转化为甘草次酸,进而发挥抗炎、抗免疫、镇痛等作用[10],其以甘草酸铵为指标成分进行含量测定。6-姜酚是生姜中主要的挥发油成分,具有抗炎、止痛、强心、抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤等作用[11]。目前,关于桂枝加芍药汤的研究多为在中医辨证论治方面,而对于化学成分的定量分析鲜有报道。为此,本研究建立了同时测定桂枝加芍药汤中芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚含量的高效液相色谱法(HPLC),旨在为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪,包括G1311C型四元梯度泵、G1315D型可变波长扫描紫外检测器、G1316A型柱温箱、OpenLABC.01.07[27]色谱工作站(美国Agilent公司);MS105DU型十万分之一电子天平(瑞士Mettler -Toledo公司);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

芍药苷对照品(批号:110736-201741,纯度:95.7%)、甘草苷对照品(批号:111610-201607,纯度:93.1%)、肉桂酸对照品(批号:110786-201604,纯度:98.8%)、桂皮醛对照品(批号:110710-201720,纯度:98.0%)、甘草酸铵对照品(批号:110731-201619,纯度:93.0%)、6-姜酚对照品(批号:111833-201303,纯度:98.0%)均购自中国食品药品检定研究院;芍药内酯苷对照品(批号:713A022,纯度:98.0%)购自北京索莱宝科技有限公司;甘草素对照品(批号:Z20J8X40265,纯度:98.0%)购自上海源叶生物科技有限公司;甲醇、乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为纯净水。

1.3 药材

桂枝饮片(批号:17050502)、赤芍饮片(批号:170201)、炙甘草饮片(批号:170507)均购自山东省中医院,大枣饮片(批号:E2017100901)购自济南东方大药店,生姜购自济南市某超市;经山东中医药大学徐凌川教授鉴定分别为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝、毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根、豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根(经蜜烘制后得到)、鼠李科植物枣(Ziziphus jujuba Mill.)的干燥成熟果实、姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的新鲜根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)(洗脱程序见表1);流速:1.0 mL/min;检测波长:235 nm(0~35 min,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷)、280 nm(35~65 min,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚);柱温:25 ℃;进样量:20 μL。

2.2 桂枝加芍药汤标准煎液的制备

称取桂枝9 g、赤芍18 g、炙甘草6 g、生姜9 g、大枣12枚,加水1 400 mL,武火煎煮,煮沸后调文火保持微沸煎煮,煎煮至药液约600 mL,8层纱布滤过,滤液加水定容至600 mL,即得。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液 取芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚对照品适量,分别置于10 mL量瓶中,加75%甲醇溶解并定容,摇匀,得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚质量浓度分别为340、1 148、98、494、610、382、1 400、800 μg/mL的单一对照品贮备液。分别精密吸取上述各单一对照品贮备液适量,置于5 mL量瓶中,加75%甲醇定容,摇匀,得芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚质量浓度分别为42.5、574.0、73.5、24.7、46.0、19.1、720.0、30.0 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液 取“2.2”项下标准煎液25 mL,置于100 mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,密闭,称定质量,超声(功率:200 W,频率:40 kHz)处理10 min,再次称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.3.3 阴性样品溶液 按“2.2”项下方法分别制备缺桂枝、赤芍、炙甘草、生姜、大枣的阴性标准煎液,再按“2.3.2”项下方法制备缺桂枝、缺赤芍、缺甘草、缺生姜、缺大枣的阴性样品溶液。

2.4 系统适用性试验

取“2.3”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图1。由图1可知,在该色谱条件下,理论板数按芍药内酯苷峰计应不低于7 000,分离度均大于1.5,阴性样品对测定无干扰。

2.5 线性关系考察

精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液0.25、0.50、1.0、2.0、4.0 mL,分别置于5 mL量瓶中,加75%甲醇定容,摇匀,得系列线性关系工作溶液。精密量取上述系列线性关系工作溶液适量,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以各待测成分质量浓度(x,μg/mL)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归,各待测成分回归方程与线性范围见表2。

2.6 定量限与检测限考察

精密量取“2.3.1”项下混合对照品溶液适量,倍比稀释,按“2.1”项下色谱条件进样测定,以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分别计算定量限、检测限。结果,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的定量限分别为0.135、0.102、0.096、0.033、0.013、0.023、0.663、0.198 μg/mL,检测限分别为0.041、0.031、0.029、0.010、0.004、0.007、0.201、0.059 μg/mL。

2.7 精密度试验

取“2.3.1”项下混合对照品溶液1 mL,置于5 mL量瓶中,加75%甲醇稀释至刻度,摇匀,按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。结果,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚峰面积的RSD分别为0.25%、0.45%、1.43%、0.64%、0.32%、1.34%、2.01%、0.32%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液适量,分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积。结果,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚峰面积的RSD分别为0.45%、0.87%、1.22%、0.65%、1.34%、2.65%、1.43%、0.69%(n=7),表明供试品溶液于室温下放置24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验

取“2.2”项下标准煎液适量,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,共6份,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算样品含量。结果,芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的平均含量分别为0.24、7.35、0.74、0.10、0.15、0.05、1.97、0.07 mg/g,RSD分别为0.62%、0.31%、1.28%、1.12%、1.56%、1.98%、2.73%、0.34%(n= 6),表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

精密吸取已知含量的标准煎液,共6份,每份2.5 mL,分别加入一定量的单一对照品贮备液,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积并计算加样回收率,结果见表3。

2.11 耐用性试验

2.11.1 流动相考察 取“2.2”项下标准煎液适量,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件(流动相中磷酸溶液体积分数分别为0.15%、0.10%、0.05%)进样测定,记录峰面积并计算样品含量,结果见表4。结果表明,当流动相发生一定程度波动时,本法能满足试验要求,提示其耐用性良好。

2.11.2 流速考察 取“2.2”项下标准煎液适量,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件(流速分别为0.9、1.0、1.1 mL/min)进样测定,记录峰面积并计算样品含量,结果见表4。结果表明,当流速发生一定程度波动时,本法能满足试验要求,提示其耐用性良好。

2.11.3 柱温考察 取“2.2”项下标准煎液适量,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件(柱温分别为20、25、30 ℃)进样测定,记录峰面积并计算样品含量,结果见表4。结果表明,当柱温发生一定程度波动时,本法能满足试验要求,提示其耐用性良好。

2.12 样品含量测定

取“2.2”项下标准煎液25 mL,按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件进样测定,平行测定3次,记录峰面积并计算样品含量,结果见表5。

對中药复方制剂进行质量控制时需要同时测定多个成分,而各成分的紫外吸收最大波长不同,因此采用多波长含量测定方法[12]。袁鹏飞等[13]采用HPLC法测定桂枝汤中9种成分的含量,在230 nm波长处检测芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷,在254 nm波长处检测桂皮醛和甘草酸,在280 nm波长处检测没食子酸、香豆素、桂皮酸及2-甲氧基桂皮醛。采用紫外检测器进行含量测定时,一般会选择某种成分的最大吸收波长。在前期试验中,笔者采用二极管阵列检测器在190~400 nm波长范围内对8个待测成分进行光谱扫描,结果发现芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚的最大吸收波长分别为230、230、240、275、285、290、255、282 nm;研究各成分的光谱图,结果发现芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷在235 nm波长处均有较大吸收,甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚在280 nm波长处均有较大吸收;综合考虑各成分峰的出峰时间,选择于235 nm(0~35 min)波长处检测芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷,于280 nm(35~65 min)波长处检测甘草素、肉桂酸、桂皮醛、甘草酸铵、6-姜酚。

本试验对甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水、乙腈-磷酸等不同流动相进行了考察。结果发现,以甲醇-水、甲醇-磷酸为流动相时,20 min附近处有2个峰分不开,以乙腈-水为流动相时,峰形不好,故选择以乙腈-磷酸为流动相;在此基础上,对流动相的浓度和比例进行优化,结果发现乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相行梯度洗脱时分离效果最好,出峰稳定且峰形尖锐,故选择乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱。

桂皮醛和6-姜酚分别为桂枝和生姜中的主要成分,但二者均为挥发性成分,在煎煮过程中易挥发,故标准煎液中的含量相对较低,但考虑到二者对汤剂整体药效的发挥具有促进作用[14],故将二者作为指标成分 。

综上所述,本研究所建方法准确、可靠,专属性好,可用于同时测定桂枝加芍药汤中8种成分的含量。

参考文献

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(收稿日期:2018-08-20 修回日期:2018-12-09)

(编辑:陈 宏)

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