AEYLR小肽修饰的紫杉醇纳米结构脂质载体的制备及抗肿瘤效果评价

韩翠艳 周建文 刘畅 马晓星 袁橙 董岩 金珊珊

摘 要 目的：制備序列为丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（简称为“AEYLR”）的小肽修饰的紫杉醇（PTX）纳米结构脂质载体（A-P-NLC），并对其体内外抗肿瘤效果进行评价。方法：采用熔融乳化-低温固化法制备纳米结构脂质载体（NLC）、PTX纳米结构脂质载体（P-NLC）和A-P-NLC，表征其外观形态、粒径、多分散指数（PDI）、Zeta电位，并检测其包封率、载药量及体外释放度；以NCI-H1299细胞和S180细胞为对象，采用CCK-8法对游离PTX、P-NLC、A-P-NLC（0.44～44.00 μg/mL，以PTX计）的细胞抑制作用进行考察，并计算其半数抑制浓度（IC50）；以S180荷瘤小鼠为模型动物，对游离PTX、P-NLC、A-P-NLC（5 mg/kg，以PTX计）的抑瘤效果进行评价。结果：P-NLC和A-P-NLC外观均呈类圆形、分布均匀；A-P-NLC的粒径、PDI、Zeta电位分别为（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（-19.77±1.16）mV，较P-NLC有所增加；A-P-NLC的包封率、载药量分别为（95.71±0.68）%、（1.97±0.25）%，较P-NLC有所降低；A-P-NLC在48 h内累积释放百分率达（35.17±2.08）%，较游离PTX表现出明显的缓释作用，且比P-NLC的释放更缓慢。与游离PTX和P-NLC比较，相同质量浓度的A-P-NLC对NCI-H1299细胞和S180细胞的抑制率大部分均显著升高，IC50值均显著降低；A-P-NLC给药处理的S180荷瘤小鼠无死亡现象，一般状态良好，且瘤体积显著缩小、瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高（P<0.05或P<0.01）。结论：A-P-NLC具有明显的缓释作用，其对NCI-H1299细胞和S180细胞的体外抑制作用以及对小鼠S180实体瘤的抑制作用均优于游离PTX和P-NLC，且毒性有所降低。

关键词 AEYLR；小肽；紫杉醇；纳米结构脂质载体；抗肿瘤；小鼠

Preparation of Small Peptide AEYLR Modified Paclitaxel Nanostructured Lipid Carriers and Evaluation of Its Anti-tumor Effects

HAN Cuiyan1，ZHOU Jianwen2，LIU Chang1，MA Xiaoxing1，YUAN Cheng1，DONG Yan1，JIN Shanshan3（1. School of Pharmacy， Qiqihar Medical College， Heilongjiang Qiqihar 161006， China； 2. School of Pharmacy， Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154007， China； 3. Dept. of Preparation， Beijing Wanquan Dezhong Pharmaceutical Technology Co.， Ltd.， Beijing 102299， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare Paclitaxel（PTX）nanostructured lipid carriers （NLC） modified by small peptide alanine-glutamic acid-tyrosine-leucine-arginine （AEYLR）， and to evaluate its anti-tumor effect in vitro and in vivo. METHODS： NLC， PTX-NLC （P-NLC） and AEYLR modified P-NLC （A-P-NLC） were prepared by emulsion evaporation-low temperature solidification curing method. Its appearance， particle size， multi-dispersion index（PDI） and Zeta potential were characterized，encapsulation rate，drug loading and in vitro drug release were detected respectively. Using NCI-H1299 and S180 cells as objects， CCK-8 method was adopted to investigate inhibitory effects of free PTX， P-NLC and A-P-NLC （0.44-44.00 μg/mL， by PTX） to those cells. The half inhibition concentration （IC50） was calculated. Using S180 tumor-bearing mice as model animal， anti-tumor effects of free PTX， P-NLC and A-P-NLC （5 mg/kg， by PTX） were evaluated. RESULTS： P-NLC and A-P-NLC were round-like and dispersed evenly. The particle size， PDI and Zeta potential of A-P-NLC were （43.92±0.76） nm，

0.203±0.034 and （-19.77±1.16） mV， which were all increased to certain extent， compared with P-NLC. The encapsulation efficiency and drug loading of A-P-NLC were （95.71±0.68）% and（1.97±0.25）%， which were both decreased to certain extent， compared with P-NLC. The cumulative release rate of A-P-NLC was（35.17±2.08）% within 48 h， showing significant sustained-release effect compared with free PTX； the release of A-P-NLC was slower than P-NLC. Compared with free PTX and P-NLC， inhibitory rates of same concentration of A-P-NLC to NCI-H1299 cells and S180 cells were almost increased significantly， while IC50 values were all decreased significantly. There was no death in S180 tumor-bearing mice treated with A-P-NLC and the general condition was good； the volume of tumors was significantly reduced， the mass of tumors was significantly reduced， and the inhibition rate of tumors was significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： A-P-NLC has significantly sustained-release effects； its inhibitory rate to NCI-H1299 cells and S180 cells in vitro， and its inhibitory effects on S180 solid tumor in mice are all better than free PTX and P-NLC， while the toxicity is decreased to certain extent.

KEYWORDS AEYLR； Small peptide； Paclitaxel； Nano- structured lipid carriers； Anti-tumor； Mice

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）是从红豆杉中提取的一种四环二萜类化合物，在临床上主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等的一线/二线治疗；其常规剂型为溶液型注射剂，但该类剂型含有的增溶剂聚氧乙烯蓖麻油会引起过敏反应，故将其制备成各种纳米制剂以降低其毒性已成为研究热点[1-4]。纳米结构脂质载体（Nanostructrued lipid carriers，NLC）是采用单甘油酯、双甘油酯、其他类甘油酯、磷脂、鞘脂类等脂质为载体，并添加一定比例的液态油，将药物吸附或包裹于脂质核中而形成的脂质纳米给药系统[5-6]。NLC具有良好的生物相容性，适于静脉注射、口服等多种途径给药[7-8]，具有极大的潜在应用价值。序列为丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-亮氨酸-精氨酸（Ala-Glu-Tyr-Leu-Arg，简称为“AEYLR”）的小肽来自于表皮生长因子受体（EGFR）自磷酸化位点Y1173，前期研究已证明其对EGFR高表达的肿瘤具有良好的体内外靶向性[9-10]。为降低抗肿瘤药物的毒性并提高其靶向性，本课题组将PTX制成AEYLR小肽修饰的NLC（简称为“A-P-NLC”），对其进行表征，并对其体内外抗肿瘤效果进行评价，为PTX抗肿瘤制剂的进一步开发提供实验基础。

1 材料

1.1 仪器

AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；HT7700型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；Zetasizer Nano-ZS90型纳米粒径电位分析仪（英国Malvern公司）；ZHWY-200D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器有限公司）；2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；5804R型台式高速大容量离心机（德国Eppendorf公司）；3111型细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；Tecan Safire 2型酶标仪（瑞士Tecan公司）；ARZ型电子数显游标卡尺（宁波市鲁匠工具有限公司）；MD44MM透析袋（美国Viskase公司，截留分子量：8 000～14 000 Da）。

1.2 药品与试剂

PTX对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：17022701，纯度：≥98%）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-AEYLR（DSPE-PEG2000-AEYLR，广州特立生物科技有限公司，批号：GT60304-0324-A，纯度：≥90%）；CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：20332）；山嵛酸甘油酯（ATO，法国Gattefossé公司）；单硬脂酸甘油酯（GMS，马来西亚KLK公司）；中链三酰甘油（MCT，北京凤礼精求商贸有限公司）；聚氧乙烯35蓖麻油（ELP）、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（HS15）（德国BASF 公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；聚山梨酯80（美国Sigma公司）；pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS，由北京酷来博科技有限公司的固体粉末产品用超纯水配制）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯化水或超纯水。

1.3 细胞

人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299、小鼠腹水瘤细胞S180均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.4 动物

SPF级昆明小鼠50只（雌性30只、雄性20只），体质量18～22 g，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK（黑）2013-001。所有动物均饲养于SPF级实验室，环境温度为18～22 ℃、湿度为50%～60%，饲喂清洁级真空包装小鼠饲料。

2 方法与结果

2.1 不同NLC样品制备

采用熔融乳化-低温固化法进行制备。称取ATO 40 mg、GMS 13 mg、MCT 27 mg、ELP 54 mg作为油相，另称取/量取HS15 54 mg、水4 mL作为水相，将油相和水相分别置于80 ℃水浴中熔融或溶解；在恒温磁力搅拌下，将油相缓慢滴入水相，待滴加完成，继续乳化10 min；随后将油水混合物迅速置于冰水浴中固化15 min，再分别经0.45 μm、0.22 μm微孔滤膜滤过后，即得NLC溶液。另外，先单独将5 mg/mL的PTX无水乙醇溶液200 μL（挥干乙醇）或与DSPE-PEG2000-AEYLR 8 mg同时加入上述油相中，再按同样的操作方法分别制得PTX纳米结构脂质载体（P-NLC）溶液和修饰有AEYLR小肽的PTX納米结构脂质载体（A-P-NLC）溶液。3种NLC样品溶液均显蓝色乳光。

2.2 P-NLC和A-P-NLC的表征

2.2.1 外观形态 取“2.1”项下制备的P-NLC、A-P-NLC样品溶液适量，以水稀释10倍后用磷钨酸负染，在电镜下观察。结果，两者外观均呈类圆形、大小均一，详见图1。

2.2.2 粒径、粒度及电位 取“2.1”项下制备的P-NLC、A-P-NLC样品溶液适量，用水稀释50倍，采用纳米粒径电位分析仪测定其粒径、粒度分布及Zeta电位。试验均重复3次。结果，P-NLC的粒径为（39.56±1.22）nm，多分散指数（PDI）为0.161±0.026，Zeta电位为（-16.34±0.85）mV；A-P-NLC的上述指标或其绝对值均有增加，分别为（43.92±0.76）nm、0.203±0.034、（-19.77±1.16）mV。P-NLC和A-P-NLC的粒径与Zeta电位分布见图2。

2.3 包封率和载药量

采用高效液相色谱（HPLC）法测定PTX含量。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（55 ∶ 45，V/V）；流速为1 mL/min；柱温为 25 ℃；检测波长为227 nm；进样量为20 μL[11]。精密称取PTX对照品适量，以流动相制成质量浓度分别为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的系列标准溶液，按上述色谱条件测定；以PTX的峰面积（A）对质量浓度（c， μg/mL）进行线性回归，得标准曲线方程为A=0.558 5c+0.910 7（r=0.999 8）。结果表明，PTX的质量浓度在5.0～100.0 μg/mL范围内线性关系良好。

采用超滤离心法[12]测定样品的载药量和包封率。取“2.1”项下制备的P-NLC样品溶液适量，置于超滤离心管（截留分子量：10 kDa，下同）中，10 000 r/min离心40 min，收集下清液，经甲醇适当稀释后，按上述色谱条件进样测定，得游离药物含量（W游离）；另取P-NLC样品溶液适量，置于离心管中，经乙腈破乳后，3 000 r/min 离心20 min，取上清液，按上述HPLC色谱条件进样测定，得总药物含量（W总）。按照公式计算P-NLC的载药量（DL）和包封率（EE）：DL（%）=（W总-W游离）/W脂质×100%，EE（%）=（W总-W游离）/W总×100%；式中，W脂质为处方中液态脂质和固态脂质的总量[13]。另取“2.1”项下制备的A-P-NLC样品溶液适量，同法测定。试验均重复3次。结果，P-NLC和A-P-NLC的载药量分别为（99.13±0.86）%、（95.71±0.68）%，包封率分别为（2.33±0.15）%、（1.97±0.25）%，A-P-NLC的载药量和包封率较P-NLC均有所降低。

2.4 体外释放度

取游离PTX和“2.1”项下制备的P-NLC和A-P-NLC样品溶液适量，采用透析法[13]模拟药物释放过程，设置截留分子量为10 kDa、释放介质为含0.2%聚山梨酯80的PBS，于0、2、4、6、8、10、12、24、48 h时取样，按“2.3”项下HPLC法测定PTX质量浓度，考察其体外释放度，并按公式计算累积释放百分率：累积释放百分率（%）=[V0×Ct+V（C1+C2+C3+……+Ct-1）]/m×100%，其中，m是加入制剂含药总量，V是每次取样体积，V0是释放介质的总体积，C1、C2、C3……Ct分别是第1、2、3……t取样时间点的浓度。试验均重复3次。结果显示，游离PTX在12 h时的累积释放率已达到（90.00±2.33）%，而P-NLC、A-P-NLC在48 h时的累积释放百分率分别为（43.05±3.74）%、（35.17±2.08）%；与游离PTX比较，P-NLC和A-P-NLC均表现出明显的缓释作用，且A-P-NLC较P-NLC的释放更缓慢，详见图3。

2.5 不同样品对NCI-H1299细胞和S180细胞的抑制作用考察

2.5.1 NLC的细胞抑制作用 采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的NCI-H1299细胞进行消化计数后接种于96孔板中（1×104个/孔），在37 ℃、5%CO2（以下培养条件同）的培养箱中培养24 h。弃去孔中培养基（即含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，以下同），分为对照组（细胞+培养基）和不同质量浓度的NLC试验组（细胞+终质量浓度分别为22、220、2 200、22 000 μg/mL的NLC，分别相当于0.11、1.10、11.00、110.00 μg/mL PTX的载体量），分别加入不含药/含药培养基100 μL，每组设置6个孔。剂量均根据预试验结果设置。各组细胞培养48 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，混匀后继续培养4 h。采用酶标仪于450 nm波长处测定各孔光密度（OD）。按照公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=ODNLC试验组/OD对照组×100%。另取对数生长期的S180细胞，同法测定NLC作用后的细胞存活率。结果显示，经不同质量浓度的NLC作用后，NCI-H1299细胞和S180细胞的存活率均在83%以上，未表现出明显细胞抑制作用，表明NLC对上述两种细胞的毒性均较小，详见图4。

2.5.2 不同PTX样品的细胞抑制作用 按“2.5.1”项下方法取细胞接种并培养，分为对照组（细胞+培养基）和各药物组（细胞+游离PTX或P-NLC或A-P-NLC的含药培养基，所含PTX的终质量浓度均分别为0.44、1.10、4.40、11.00、44.00 μg/mL）；另设不含细胞的空白组（培养基），每组设置6个孔。剂量均根据预试验结果设置。按照“2.5.1”项下方法培养并测定各孔OD值，并按公式計算细胞抑制率：细胞抑制率（%）=（OD药物组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。采用SPSS 17.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验（P<0.05为差异有统计学意义）；同时，计算药物的半数抑制浓度（IC50）。

结果显示，当PTX质量浓度为0.44～44.00 μg/mL时，各样品对两种细胞的抑制率随着PTX浓度增加而呈升高趋势，表明不同PTX样品对两种细胞的抑制作用均具有剂量依赖趋势；与游离PTX比较，在相同质量浓度的P-NLC和A-P-NLC作用下，两种细胞的抑制率均显著升高，IC50值均显著降低；与P-NLC比较，在相同质量浓度的A-P-NLC作用下（除1.10 μg/mL外），两种细胞的抑制率均显著升高，IC50值均显著降低。以上差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），详见图5、表1。

2.6 A-P-NLC的体内抗肿瘤实验

2.6.1 S180荷瘤小鼠模型建立 取对数生长期的S180细胞，以4 ℃生理盐水漂洗并调节细胞浓度至1×107个/mL，按200 μL/只接种于小鼠（雌性10只）的腹腔[14]。4～5 d后可见小鼠腹部凸起、明显增大，此时取其S180腹水瘤细胞用于传代[13]。传至第3代后，抽取腹水瘤模型小鼠的腹水，以4 ℃生理盐水漂洗并调节细胞浓度至1×108个/mL，另取小鼠（雌雄各20只），按200 μL/只注射至其腋窝皮下，并观察其腋窝处实体瘤形成情况。当小鼠腋窝处出现小的突起且触摸有硬结感时，即为荷瘤造模成功。

2.6.2 A-P-NLC的体内抗肿瘤作用考察 取“2.6.1”项下造模成功的荷瘤小鼠32只，随机分为对照组、游离PTX组、P-NLC组、A-P-NLC组，每组8只。各组小鼠均尾静脉给药100 μL/次，隔天1次，连续8次。除对照组给予生理盐水外，各给药组的给药剂量均以5 mg/kg PTX计算，剂量根据预试验结果设置。每天观察小鼠一般状态，并测量其体质量；以游标卡尺测量肿瘤垂直方向上的长径（a）和短径（b），计算肿瘤体积（V=ab2/2）[15]；末次给药24 h后处死小鼠，剖取肿瘤，称定瘤质量，并按公式计算瘤质量抑制率：瘤质量抑制率（%）=（1-给药组瘤质量/对照组瘤质量）×100%[16]。统计学方法同“2.5.2”项。

结果显示，给药期间，对照组小鼠肿瘤增长速度快，前期进食和饮水量正常、毛发光亮，后期随着肿瘤变大，其活动变迟缓、毛发变得不光亮，有1只小鼠死亡；游离PTX组小鼠出现躁动、尖叫等现象，精神状态不佳，毛发不光亮，食欲减退，活动量减少，有3只小鼠死亡；P-NLC组、A-P-NLC组小鼠状态较好，毛发光亮，进食和饮水量正常，其中P-NLC组有1只小鼠死亡。对照组和游离PTX组小鼠体质量增长较慢，而P-NLC组和A-P-NLC组小鼠体质量增长明显，详见图6。

各组小鼠瘤体积均随时间延长而呈增加趋势；与对照组比较，各给药组小鼠自给药3 d时起瘤体积均显著缩小，P-NLC组和A-P-NLC组小鼠在末次给药后24 h时瘤质量均显著降低；与游离PTX组比较，P-NLC组和A-P-NLC组小鼠分别自给药7、5 d时起瘤体积显著缩小，在末次给药后24 h时瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高；与P-NLC组比较，A-P-NLC组小鼠自给药7 d时起瘤体积显著缩小，在末次给药后24 h时瘤质量显著降低、瘤质量抑制率显著升高。以上差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）

3 讨论

经PEG修饰的NLC可通过“高渗透、长滞留”效应被动靶向进入肿瘤组织，即通过肿瘤微血管的空隙渗漏进入肿瘤组织，但进入肿瘤组织的NLC因其表面修饰有PEG故親水性增强，会使其跨膜进入细胞受到影响；AEYLR小肽对EGFR具有特异的靶向性，可使连接有AEYLR的NLC对EGFR高表达的细胞及肿瘤组织具有主动靶向作用，同时还可通过EGFR受体介导肿瘤细胞对NLC的内吞，提高NLC的入胞量[9-10]。

DSPE-PEG2000-AEYLR是AEYLR通过PEG末端活化技术连接在DSPE-PEG2000末端的产物。本研究采用熔融乳化-低温固化法制备A-P-NLC，在乳化过程中DSPE-PEG2000-AEYLR结构中的亲水部分PEG2000- AEYLR存在于乳滴表面，而在低温固化后AEYLR部分即被修饰到了P-NLC的表面。与P-NLC比较，A-P-NLC在制备过程中加入了DSPE-PEG2000-AEYLR，增加了NLC表面PEG的量，导致粒径、粒度分布及Zeta电位绝对值均有所增长，同时空间位阻的增加使其包封率和载药量略有降低；二者的体外释放行为相似，均有缓释效果，但A-P-NLC的缓释效果更为明显，可能是由于DSPE-PEG2000-AEYLR的加入使P-NLC的结构变得更加稳定，从而使药物释放更缓慢。

本研究选择EGFR高表达的人非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299和鼠源S180细胞系[17-18]作为模型细胞，主要考察了A-P-NLC对两种肿瘤细胞的体外抑制效果。结果显示，与游离PTX和P-NLC比较，加入了具有主动靶向作用的AEYLR后，A-P-NLC显示出更强的体外肿瘤细胞抑制效果。而进一步采用S180细胞建立小鼠荷瘤模型并进行体内抑瘤作用考察的结果显示，与游离PTX组和P-NLC组比较，A-P-NLC组小鼠的瘤体积、瘤质量均显著缩小或降低，瘤质量抑制率均显著升高；另外，游离PTX组有3只小鼠由于PTX的长期毒性而死亡，而P-NLC组与A-P-NLC组小鼠死亡情况减少，且体质量较游离PTX组显著增长，提示PTX制成NLC后可减小药物的毒副作用，提高用药安全性。

综上，A-P-NLC具有明显的缓释作用，其对NCI- H1299细胞和S180细胞的体外抑制作用以及对小鼠S180实体瘤的抑制作用均优于游离PTX和P-NLC，且毒性有所降低。

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（收稿日期：2018-09-28 修回日期：2019-01-22）

（编辑：段思怡）