天山雪莲组织培养体系的优化

丁黛灵 陈芸 魏炯河 张振霞 郑玉忠

摘要：通过研究天山雪莲种子消毒萌发条件、愈伤组织培养和继代培养条件，优化出了一套能获得总黄酮成分含量较高的天山雪莲愈伤组织的组织培养体系。结果表明：将种子用70%乙醇处理30 s、0.1%升汞溶液处理10 min，并种植于MS培养基，可获得生长状态良好的雪莲苗。比较了7种培养基对天山雪莲无菌苗叶片愈伤组织的诱导情况，愈伤诱导率均能达到100%，其中4种培养基获得愈伤组织适合继代培养。在继代培养中，①号培养基的愈伤组织易分化出根，②号培养基、③号培养基的愈伤组织易分化出芽;④号培养基可得到較多黄绿色致密愈伤组织。对①号、②号、③号、④号培养基获得愈伤组织的总黄酮含量检测，发现其总黄酮含量为1.14%～7.37%，远高于《中华人民共和国药典（2015版）》不少于0.15%的规定，以②号培养基的愈伤组织总黄酮含量最高。

关键词：天山雪莲;组织培养;总黄酮

中图分类号：S567         文献标志码：A         文章编号：1001-1463（2019）06-0025-04

Abstract：By studying the germination conditions， callus culture conditions and secondary culture conditions of Saussurea involucrata， we optimized the tissue culture system to obtain the callus with high content of total flavonoids. The results showed that the seeds were treated with 70% ethanol for 30 seconds and 0.1% mercury solution for 10 minutes， and planted on MS medium， the seedlings of Saussurea involucrata in good growth condition could be obtained. The induction of callus from leaves of Saussurea involucrata Sterile seedlings on 7 media was compared. The induction rate of callus could reach 100%. Among them， 4 the obtained callus were suitable for subculture. In subculture， callus of No. 1 medium was easy to differentiate into roots， callus of No. 2 and No. 3 were easy to differentiate into buds， and callus of No. 4 medium could obtain more yellow-green dense callus. The content of total flavonoids in callus obtained from medium No. 1， No. 2， No. 3 and No. 4 was determined. It was found that the content of total flavonoids was 1.14%～7.37%， which was much higher than that stipulated in Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）.  The content of total flavonoids in callus obtained from callus of No. 1 medium was the highest.

Key words：Saussurea involucrata;Tissue culture;Total flavonoids

天山雪莲[Saussurea involucrate （Kar.et Kir.）Sch.-Bip.]为菊科凤毛菊属多年生高山草本植物，其地上部分是中国维吾尔族习用药材。性温、微苦，具有温肾助阳、祛风胜湿、通经活血等功效，主要用于风寒湿痹痛、类风湿性关节炎及小腹冷痛、月经不  调[1 ]。天山雪莲生境特异，自然繁殖率低，生长慢，人工栽培困难，长期掠夺性采挖使其野生资源濒临灭绝。1996年中国已将天山雪莲列为国家二级保护植物。2000年国务院13号文件已明令禁止采挖野生雪莲。

天山雪莲含有多种黄酮类物质[2 ]，组织培养技术可为天山雪莲次生代谢产物的生产提供切实可行的手段[3 ]，是解决天山雪莲资源短缺的有效途径。20世纪90年代开始，就有雪莲组织培养的相关文献报道。近年来对雪莲的组织培养、药用成分测定的报道较多，取得了一定进展。我们利用植物组织培养技术对天山雪莲幼苗进行诱导增殖，同时对天山雪莲培养物成分进行分析比较研究，得出合适的组织培养条件和测定方法，有利于天山雪莲的资源化和保护化研究。

1   材料与方法

1.1   供试材料

野生天山雪莲种子由香港科技大学中药研发中心提供。选取健壮饱满、无病虫害的种子（千粒重3.544 g）。

以MS为基本培养基，附加蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L，不同浓度2，4-D、NAA、6-BA等激素，pH 5.8。所有培养基均在121℃条件下高压灭菌15 min。

培养室温度（20±2） ℃，空气湿度50%～ 60%，光照时间12 h/d，光照强度1 000～   1 500 lx。

1.2   方法

1.2.1    天山雪莲种子萌发条件优化    自然条件萌发：种子用蒸馏水浸泡过夜，置于湿滤纸上，发芽后移至装有土壤的花盆继续生长。消毒后萌发：种子在70%乙醇浸泡30 s，用无菌水冲洗2～3次后在0.05%升汞溶液或0.1%升汞溶液中消毒10 min，然后用无菌水清洗4次后并浸泡过夜，置于含有湿滤纸的灭菌培养皿中，发芽后移至MS基础培养基中培养，5 d时统计不同处理的种子萌发率，30 d时统计不同处理的幼苗存活率。

1.2.2    不同植物激素配比对天山雪莲无菌苗叶片外植体诱导的影响    在MS培养基中加入不同剂量植物激素，配制7种不同的愈伤组织诱导培养基，具体配比及剂量详见     表1[4 - 7 ]。将在无菌环境培养的雪莲无菌苗叶片剪成约0.5 cm×0.5cm大小的外植体，分别接种到①号、②号、③号、④号、⑤号、⑥号、⑦号诱导培养基上，于20 ℃，12 h/d光照条件下培养观察。同时将所有愈伤组织收集，以备后续检测。

1.2.3    天山雪莲愈伤组织培养物总黄酮成分测定    精密称取芦丁对照品5 mg，置于25 mL容量瓶中，用60%甲醇溶解定容，作为0.2 mg/mL芦丁对照品溶液。分别精密量取对照品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶，加蒸馏水至6.0 mL;加5%亚硝酸钠1 mL，混匀后静置6 min;再加10%硝酸铝1 mL，混匀后静置6 min;然后加4%氢氧化钠10 mL，再加蒸馏水定容。用分光光度计在510 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线[8 ]。

精密称取干燥的天山雪莲固体培养物细粉10 mg，置于15 mL离心管中，加60%甲醇10 mL，称重记录，超声提取15 min，用60%甲醇补足失重，离心，取上清液为供试品溶液。

2   结果与分析

2.1   天山雪莲种子的萌发

由表2结果显示，天山雪莲种子在自然条件与0.1%升汞溶液消毒下的萌发率相近，远高于0.05%升汞溶液消毒的萌发率。由于广东潮州地区气温高，自然条件下的雪莲苗基本无法存活，采用消毒和培养基培养的方法获得的萌发苗存活较理想。比较3种方法，采用70%乙醇处理30 s，0.1%升汞溶液处理10 min、无菌水清洗4次的方案效果较好，存活率高且污染率低。

2.2   不同培养基对天山雪莲无菌苗叶片外植体诱导培养的影响

从7种培养基对天山雪莲无菌苗叶片愈伤组织诱导的情况（表3）可以看出，7种不同的培养基对天山雪莲无菌苗叶片的愈伤组织诱导效果都理想，均为100%，但⑤号、⑥号、⑦号培养基培养愈伤组织偏黄褐色，比较干，不太适合后期的培养生长。

2.3   不同固体培养基继代培养天山雪莲的情况

取上述①号、②号、③号、④号培养基的愈伤组织，用相应的培养基进行继代培养。表4和图1结果显示，①号培养基的愈伤组织易分化出根，文献未有报道此现     象[4 ];②号培养基和③号培养基的天山雪莲愈伤组织均可分化出芽，而③号培养基的愈伤组织分化出的芽多且成活率较高，文献中未有报道此现象[5 - 6 ];在④号培养基可得到较多绿色致密性愈伤组织。可见，若要得到更多的再生植株，可使用①号培养基诱导愈伤组织，再分化生根，然后转移至③号培养基使其分化生芽;若要得到较多的绿色致密性愈伤组织，可选用④号培养基，④号培养基继代培养时愈伤组织生长速度快，颜色由绿色转变成黄绿色。

2.4   不同培养基上的天山雪莲愈伤组织中的总黄酮成分测定

以芦丁标准溶液浓度（X）为横坐标，OD值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程：Y=12.05X-0.005，R2=0.999 8。当芦丁浓度在0～0.05 mg/mL内，呈良好的线性关系。

精密称取干燥的天山雪莲固体培养物，测定其总黄酮含量，结果顯示，①号、②号、③号、④号培养基中总黄酮含量分别为2.59%、7.37%、5.76%、1.14%（表5），远高于《中华人民共和国药典（2015版）》中总黄酮含量不少于0.15%的规定。说明应用组织培养获得的天山雪莲愈伤组织是具备药用价值的。

3   结论与讨论

资源问题依然是限制新疆雪莲开发利用的瓶颈，植物的组织细胞培养已经成为解决此问题的有效途径[5 ]。雪莲的人工栽培已取得初步成效，组织培养研究已有较多成     果[9 ]，寻找一种较优的天山雪莲组织培养体系非常必要。从对天山雪莲种子采用70%乙醇30 s，0.1%升汞10 min，无菌水冲洗4次和接种无菌湿滤纸的处理方法不仅可以获得与自然条件下相近的萌发率，且污染率较低，萌发苗存活率较好。无菌萌发苗最好是在环境温度（19±2 ℃）和湿度（57%以上）较为适宜且稳定的条件下在培养基中进行无菌培养（光照12 h/d）。

从对天山雪莲叶片的愈伤组织的诱导率来看，几种培养基的诱导效果都很好，其中①号培养基诱导和培养的天山雪莲愈伤组织易分化出根;③号培养基可较好诱导和培养天山雪莲愈伤组织分化出芽，且在黑暗条件下更容易分化出芽;在④号培养基上诱导和培养可得到较多黄绿色致密性愈伤组织。由此可见，不同培养基可用于天山雪莲分化苗不同阶段的生产培育。②号培养基和③号培养基的生长素/细胞分裂素的比值是有差异的，②号培养基为2∶1，③号培养基为4∶1，但也都出现分化芽，可能与天山雪莲内源激素有关，需做进一步研究[5 ]。

各个条件下天山雪莲组织培养物总黄酮测定结果均符合《中华人民共和国药典（2015版）》规定的含量，不同培养基的天山雪莲培养物总黄酮的含量均有差异，可为天山雪莲总黄酮的生产提供参考依据。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.  中华人民共和国药典（一部）[M].  北京：中国医药科技出版社，2015：53-54.

[2] 王   强，刘运权，王   涛，等.  不同产地雪莲中绿原酸和芦丁含量测定及其煎煮提取工艺优化[J]. 中国药房，2016，27（25）：3539-3541.

[3] 陈日道，刘   晓，邹建华，等.  雪莲悬浮培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的生物合成调控[J].  中國中药杂志，2014，39（12）：2275-2280.

[4] 胡雪梅，秦   丽，贺   宾，等.  新疆雪莲组织培养体系的优化[J].  新疆农业科学，2007（3）：333-335;385

[5] 覃建兵，庞红霞，祝长青.  植物激素对新疆雪莲愈伤组织诱导和分化的影响[J].  华中师范大学学报（自然科学版），2009，43（4）：633-636.

[6] 刘   莹.  雪莲组织培养及次生代谢调控研究[D].  沈阳：沈阳药科大学，2009.

[7] 林   侃，王晓军，赵民安，等.  新疆雪莲体胚诱导与分化研究[J].  西北植物学报，2006（7）：1351-1354.

[8] 吕亚丽，王艳芳，张福生，等.  不同理化因素对雪莲组培苗生长及总黄酮量的影响[J].  中草药，2012，43（1）：173-177.

[9] 韦善君，武运芳，罗云燕，等.  濒危药用植物新疆雪莲资源的研究进展[J].  中央民族大学学报（自然科学版），2014，23（2）：10-15.

（本文责编：郑立龙）