南方红豆杉根腐病病原菌与其拮抗菌的鉴定分析

摘要：  本文首先提出采用常规分离法对南方红豆杉根腐病病原菌进行分离，并探究其拮抗菌。通过筛选得到YB27的抑菌效果最好，对其进行稳定性分析得到：在培养的前6天，YB27对病原菌的抑制作用逐渐增强;在100 ℃以下，可继续抑菌30 min;对氯仿不敏感，可在有机溶剂中保持稳定，且紫外照射对YB27抑菌效果无影响。但YB27稳定性可能会受到土壤pH值、红豆杉生长情况、土壤微生物等影响。

关键词：  南方红豆杉;  根腐病病原;  拮抗芽孢杆菌;  鉴定

中图分类号：   S 791. 49， S 763. 7               文献标识码：   A                文章编号：1001 - 9499（2019）06 - 0023 - 03

南方红豆杉（Taxus mairei）是国家一级保护植物，也是世界珍稀树种，不仅有绿化、造林等价值，还可从其根、茎、叶中提取抗癌药的新成分——紫杉醇，具有药用价值。因南方红豆杉出苗率较高，故成为贵州地区的重点引进品种，但随着贵州地区红豆杉种植面积的增加，南方红豆杉病虫害问题也愈加严重，尤其是根腐病，其危害面積最大，病情最为严重，发病率达到了30%，给防治工作带来了极大的困难。因此，本文从已患根腐病的红豆杉根部分离致病菌株，并对病原菌进行鉴定，同时筛选其拮抗菌，旨在提升南方红豆杉根腐病的防治效果。

1 试验材料

从贵州省岑巩县思凯林业发展有限公司，凯本工区苗圃基地获取南方红豆杉根腐病典型症状的病株。

2 试验方法

2. 1 病原菌的分离

采用常规分离法分离病原菌。将病株清洗干净，在根腐病病健交界位置切取4 mm×4 mm的病组织，置于乙醇中浸泡1～2 min，再放入1 g/L氯化汞中灭菌3～4 min，然后用无菌水冲洗3～4次，将其置于PDA上进行培养，长出菌丝后，挑取菌落旁菌丝放置到新鲜PDA中培养，单孢纯化之后获得菌种，保存到PDA斜面上，在4 ℃冰箱中备用。

2. 2 病原菌的鉴定

采用柯赫氏法则验证病原菌的致病性。将分离得到的真菌转移到PDA培养基中培养1周后，加入无菌水清洗孢子，制作真菌孢子悬浮液。采用伤口接种方法，选择株高10 cm左右的无病栽培苗，在其距离土面3～5 cm的位置，使用灭菌刀处理其根系表皮，于伤口位置滴加孢子悬浮液，剂量为2 mL/株，共接种30株，以无菌水作为对照[ 1 ]。在接种发病病株根部获取腐根木质、韧皮病健交界组织，采用组织分离法分离病原菌，将病原菌接种到PPA，置于25 ℃恒温培养箱中培养，观察菌落形态特征并进行鉴定。

2. 3 拮抗芽孢杆菌筛选筛选

采集健康植株根际土样，先进行风干处理，之后放入瓶中剧烈摇晃30 min，再放入到水浴中保持20 min，最后使用无菌水进行梯度稀释，涂布NA平板上，在37℃培养箱中培养24 h，选择菌落形态明显的单菌落进行初次筛选。初筛采用PDA平板对峙生长法，将3 mm病原菌琼脂块放入到平板中央，同时将获得的拮抗菌株点接在病原菌琼脂块四周，距离为3 cm，3次重复，在25 ℃培养箱中培养3～5天，有抑制作用的菌株再次进行筛选。最后筛选出3株有明显抑制作用的菌株，测量其抑菌带大小和抑菌率[ 2 ]。

2. 4 拮抗菌株鉴定

对3种菌株进行NA培养24 h，获取菌体革兰氏染色，用显微镜观察其形态及菌落特征。

2. 5 最优拮抗菌的稳定性分析

2. 5. 1 培养时间的影响

以南方红豆杉根腐病致病菌为指示菌，采用打孔法[ 3 ]（即灭菌打孔器打取直径为8 mm致病菌菌饼接种于PDA平板中央，置于27 ℃恒温培养箱中培养2天后，在PDA平板上距离菌饼中心3 cm处打4个直径为6 mm的孔，以孔内注入0.1 mL最优拮抗菌菌株无菌发酵滤液为试验组，以孔内注入无菌水为对照组）对最优拮抗菌菌株无菌发酵滤液进行拮抗活性检测，3次重复，分别于培养的第2、3、4、5、6、7天测量抑菌宽度。

2. 5. 2 温度的影响

将最优拮抗菌无菌发酵滤液分别置于25、40、60、80、100、120 ℃ 6个温度梯度下水浴处理30 min、以未处理最优拮抗菌无菌发酵滤液为对照，每处理3次重复。以南方红豆杉根腐病致病菌为指示菌，采用打孔法进行拮抗试验，5天后测量抑菌宽度。

2. 5. 3 pH值的影响

配制pH值分别为4、5、6、7、8、9、10的磷酸缓冲液，将0.5 mL的最优拮抗菌无菌发酵滤液与0.5 mL不同pH值的磷酸缓冲液混和，每次处理3次重复，以未处理的最优拮抗菌无菌发酵滤液为对照，采用打孔法进行拮抗试验，5天后测量抑菌宽度。

2. 5. 4 有机溶剂的影响

取最优拮抗菌无菌发酵滤液10 mL与等体积的氯仿混合，200 r/min震荡抽提90 min后离心，待分层后，采用打孔法进行拮抗试验。取上层水溶液检测是否有抑菌活性;然后再将絮状沉淀水溶解之后检测是否有抑菌活性，每次处理3次重复，以未处理的最优拮抗菌无菌发酵滤液为对照，5天后测量抑菌宽度。

2. 5. 5 紫外线的影响

将最优拮抗菌无菌发酵滤液置于距20 W紫外灯40 cm处，分别用紫外线照射1、2、3、4、5、6 h，每处理3次重复，以未处理的最优拮抗菌无菌发酵滤液为对照，采用打孔法进行拮抗试验，5天后测量抑菌宽度。

3 试验结果

3. 1 病原菌鉴定结果

3. 1. 1 病害症状

该病发病初期呈现褐斑，之后皮层逐渐腐烂、发黑、发霉，木质颜色逐渐变深，根皮上出现了腐烂水渍，由下到上逐渐演变为红褐色，严重时枝叶萎蔫失水，最后植株死亡。发病症状和南方红豆杉根腐病保持一致，发病率为100%，而对照组并没有出现病症，再次分离后，得到的菌落形态与首次分离的相同，因此可确定是红豆杉根腐病病原菌。

3. 1. 2 形态特征

观察得到菌落生长速度大约为1.2 cm/天，第4天和第5天生长速度最快，5天之后菌落为圆形，直径6 cm，菌丝白色、茂盛、紧密;菌落旁为放射状，边缘乳白色。结合《真菌鉴定手册》，初步鉴定为尖孢镰刀菌。

3. 2 拮抗菌株的筛选和鉴定

3. 2. 1 拮抗菌株的筛选

经筛选，最终得到3株对南方红豆杉病原菌拮抗良好的菌株，分别为YB5、YB17、YB27，抑菌率均在30%以上，且以YB27效果最好，抑菌率可达到50%左右。

3. 2. 2 拮抗菌株的鉴定

经过鉴定，YB5、YB17、YB27分别与蜡样芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、多黏类芽孢杆菌形态一致。其中，多黏类芽孢杆菌拮抗效果最好，是一种非常有潜力的生防菌。在试验中进一步对YB27菌株的无菌发酵滤液抑菌性进行研究发现：常温下，无菌发酵滤液对病原的抑制作用不明显，进行水浴加热后，无菌发酵滤液对致病菌抑制作用十分明显。可能是由于YB27粘度大，无法将细胞、细胞外代谢物质分开，而水浴加热可以有效降低细胞粘度。

3. 3 YB27的稳定性分析

3. 3. 1 培养时间的影响

在培养的前6天里，YB27菌株无菌發酵滤液对病原菌抑菌效果是逐渐提升的，在6天之后，抑菌性能开始平缓。

3. 3. 2 温度的影响

由不同温度对YB27菌株无菌发酵液的影响（图1）可知：YB27经100 ℃以下水浴处理后，对病原菌的抑制作用仍可持续30 min。当温度提升到120 ℃时，抑菌活性才有所下降，但抑菌宽度依然非常高。表明YB27热稳定性非常强。

3. 3. 3 pH值的影响

由不同pH值对YB27菌株无菌发酵液的影响值（图2）可知：相比对照组，YB27滤液pH值在4～10范围内，抑菌宽度没有明显差异，表明YB27菌株无菌发酵滤液在酸性、碱性环境中都可以保持稳定。

3. 3. 4 有机溶剂的影响

经检测，上层水溶液无抑菌活性;絮状沉淀水溶解之后有抑菌活性，且和对照组没有显著差异性。表明YB27对氯仿不明感，可以在有机溶剂中保持稳定。

3. 3. 5 紫外线的影响

由紫外线对YB27菌株无菌发酵液的影响（图3）可知：随着紫外线照射时间的增加，抑菌宽度无明显差异，即在紫外线照射下YB27依然可以保持稳定。

4 结 论

综上所述，本文采用实验室环境进行根腐病病原与拮抗芽孢杆菌鉴定，但实验环境和自然环境相差甚远，投入防治的YB27可能会受到土壤pH值、红豆杉生长情况、土壤微生物等影响，进而影响YB27稳定性。因此，在技术成熟的情况下，需要进行田间试验，为抑制南方红豆杉根腐病提供更多的数据。

参考文献

[1] 谯天敏，  罗蓉，  朱天辉.  南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定[J].  植物保护，  2015（6）：  60 - 66.

[2] 罗蓉.  南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽孢杆菌研究[D].  2016.

[3] 任小霞，  郝锐，  秦雪梅.  山西省黄芪根腐病优势病原菌的鉴定及拮抗芽孢杆菌的室内初筛[C]// 中国植物保护学会2015年学术年会，  2015.

第1作者简介：  滕建东（1984-），  男，  本科，  工程师 ，  主要从事林业有害生物防治。

收稿日期： 2019 - 08 - 01

（责任编辑：   李 丹）