红毛五加多糖对大鼠肝细胞免疫损伤的保护作用及其机制

李青青 吴疆 郑碧荣 李儒月 王书贤 朱耀强

摘 要： 紅毛五加属于五加科植物，而五加科植物大多具有调节免疫力的双向调节作用，红毛五加多糖是从中药红毛五加中提取的单一组分，目前关于红毛五加多糖的抑炎作用还少有报道。为了探究红毛五加多糖AHP-Ⅱ对LPS导致的大鼠肝细胞免疫损伤的保护作用及其作用机制，该研究将实验分为空白组、模型组（LPS，40 μg·mL-1）和AHP-Ⅱ低、中、高剂量组（25，50，100 μg·mL-1）五组，以LPS（40 μg·mL-1）来制备大鼠肝细胞免疫损伤模型，先用ELISA方法检测细胞分泌TNF-α的水平及流式检测ROS的含量，来探究AHP-Ⅱ不同剂量对炎症因子的抑制作用，再用western方法检测P-JNK2的蛋白水平来进一步探究AHP-Ⅱ的抑制作用机制。结果表明：低、中、高剂量组的AHP-Ⅱ均可使肝细胞损伤后的TNF-α含量下降。同时，AHP-Ⅱ中、高剂量组均可使损伤后的肝细胞ROS的分泌量下降，且AHP-Ⅱ高剂量组抑制ROS的作用最强。在加入AHP-Ⅱ后，JNK2蛋白的磷酸化水平呈剂量依赖性降低，AHP-Ⅱ高剂量组抑制作用最强。这说明红毛五加多糖AHP-Ⅱ可以通过降低P-JNK2的蛋白含量来抑制炎症因子TNF-α及ROS的水平，以发挥免疫保护作用。

关键词： 红毛五加多糖， 脂多糖， 肝损伤， JNK

中图分类号： Q946， R285  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2019）07-0880-07

Abstract： Acanthopanax giraldii belongs to the Araliaceae plant， and most of the Araliaceae plants have a two-way regulation effect in regulating immunity. A. giraldii polysaccharide is a single component extracted from the traditional Chinese medicine A. giraldii. The anti-inflammatory effect of polysaccharides has rarely been reported. This study aimed to explore the protective effect and mechanism of polysaccharide AHP-Ⅱ on LPS-induced hepatocyte injury in rats. This experiment was divided into five groups： blank group， model group （LPS， 40 μg·mL-1）， AHP-Ⅱ low， moderate， high-dose group （25， 50， 100 μg·mL-1）. LPS （40 μg·mL-1） was used to prepare the rat hepatocyte immune injury model. The cytotoxic effect of AHP-Ⅱ on hepatocytes was first examined by CCK-8 method to eliminate interference， and the secreted level of TNF-α by the cells and the level of ROS were measured by ELISA and flow cytometry respectively to establish the hepatocyte immune injury model. Then the inhibitory effect of different doses of AHP-Ⅱ on inflammatory factors was explored， and the level of JNK2 protein and its phosphorylation were detected by western method to further explore the inhibitory mechanism of AHP-Ⅱ. The results showed that the experimental dose of AHP-Ⅱ had no damage to cells by CCK-8 method， which indicates that the reduction of inflammatory factors secreted by cells treated by AHP-Ⅱ is not due to its cytotoxic effect. AHP-Ⅱ groups （25， 50， 100 μg·mL-1） decreased TNF-α content durig hepatocyte injury. At the same time， the high-dose AHP-Ⅱ group can reduce the secretion of ROS durig hepatocytes injury， and the high-dose AHP-Ⅱ group has the strongest effect in inhibiting ehe conrent of ROS. After the addition of AHP-Ⅱ， the phosphorylation level of JNK2 protein decreased in a dose-dependent manner， and the AHP-Ⅱ high-dose group had the strongest inhibitory effect. This indicate that the polysaccharide AHP-Ⅱ can play an immunoprotective role by reducing the protein content of P-JNK2 and inhibiting the levels of TNF-α and ROS. The results of this study provide a scientific reference for the hepatoprotective effect of A. giraldii， and promote the further development and utilization of the resources of A. giraldii.

Key words： Acanthopanax giraldii polysaccharide， lipopolysaccharide， liver injury， JNK

红毛五加为五加科多年生灌木，它的药用部位为密生刺毛的茎皮，称为红毛五加皮。五加科植物大多具有祛风湿、通关节、补肝肾、强筋骨的功效。有研究结果显示，刺五加水提物能显著增加小鼠单核一巨噬细胞的吞噬功能，并能显著提高小鼠迟发超敏反应的程度，此外，显著增加了小鼠的脾脏和胸腺的脏器系数，提示刺五加能增强机体免疫防御能力，并且这种免疫增强作用与促进巨噬细胞活化有关（王瑞强等，2013）。此外，还有研究发现，当给小鼠腹腔注射刺五加水提物后，可检测到刺五加水提物明显抑制了小鼠腹腔巨噬细胞在LPS&IFN-γ诱导刺激下产生的NO、 ZYM诱导刺激下产生的 O2- · 和PMA诱导刺激下产生的H2O2的含量，结果提示刺五加水提物可能通过抑制活化巨噬细胞产生的炎症介质发挥其抗炎功效（林秋叶，2007）。这些结果表明大多数由五加科提取的有效成分都有抑制炎症反应和促进免疫细胞活性的双重作用（Chien et al.， 2015;孙永杰，2012）。课题组前期从中药红毛五加中提取了一种单一组分红毛五加多糖AHP-Ⅱ，前期研究发现它具有促进免疫活性的作用，而现有的关于红毛五加多糖抗炎的研究却少有报道，为了进一步探究AHP-Ⅱ对肝损伤的作用，我们用LPS诱导大鼠肝细胞BRL损伤，模拟了人类免疫性肝损伤模型，用AHP-Ⅱ刺激，来探究单一组分是否具有“保肝”的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640（Gibco公司）;胎牛血清（Gibco公司）;青链霉素混合液（购自北京索莱宝科技有限公司）LPS（sigma）;TNF-α检测盒（eBioscience）;活性氧检测试剂盒（Beyotime）;磷酸化兔抗鼠JNK2和P-JNK2抗体（ Cell Signal Technoloy）;辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔的二抗（Cell Signal Technoloy）;化学发光试剂盒（Thermo）;红毛五加多糖AHP-Ⅱ由课题组前期制得;BRL大鼠肝细胞株购自中科院上海细胞研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠肝细胞BRL，用含有10%的胎牛血清的1640培养基置于37 ℃，5%CO2培养箱中传代培养，隔天传代。随着实验目的的不同接种于培养板上。

1.2.2 AHP-Ⅱ细胞毒性检测 将大鼠肝细胞BRL，以每孔103个细胞的密度接种于96孔板内。实验分为（1）空白组、（2）AHP-Ⅱ低剂量组（25 μg·mL-1）、（3）AHP-Ⅱ中剂量组（50 μg·mL-1）、（4）AHP-Ⅱ高剂量组（100 μg·mL-1）。空白组添加等量的无血清1640培养基，各组分别按分组加好药物，放入37 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h后，用CCK-8检测AHP-Ⅱ对细胞的增殖毒性。

1.2.3 ELISA检测TNF-α的含量 将大鼠肝细胞BRL，以每孔106个细胞的密度接种于6孔板内。按照1.2.2的方法培养细胞，另增设LPS模型对照组（40 μg·mL-1），各组分别按分组加好药物，放入37 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h后，收集上清，按照ELISA说明书检测上清中的TNF-α细胞因子的含量。

1.2.4 流式细胞术检测ROS的表达 将大鼠肝细胞BRL，以每孔106个细胞的密度接种于6孔板内。按照1.2.3的方法培养细胞24 h后，收集细胞，用流式细胞仪检测ROS的含量。

1.2.5 用western blot检测JNK磷酸化情况 按1.2.3方法处理细胞后，加药刺激1 h后提取总蛋白，检测JNK2蛋白及其磷酸化蛋白的水平。

1.3 数据分析

所有数据采用SPSS17.0软件进行分析，多组间比较用LSD-t检验。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的AHP-Ⅱ对肝细胞毒性的影响

为排除细胞数目对炎症因子的影响，用CCK-8检测了AHP-Ⅱ不同工作浓度下对肝细胞的毒性作用，由表1结果可知，在低、中、高三个不同浓度下，AHP-Ⅱ对细胞增殖没有毒性作用。

2.2 不同浓度的AHP-Ⅱ对肝损伤后分泌细胞因子的影响

TNF-α是引起急慢性肝损伤的重要因素之一，其具有细胞毒性作用，能够通过激活T， B淋巴细胞、增强NK细胞的杀伤能力，来间接或直接引起肝细胞的免疫损伤，还可诱导TNF-α本身、IL-8、IL-6等细胞因子的大量分泌， 介导肝细胞的功能受损，加重肝功能损伤。为了构建免疫性肝损伤模型，我们用LPS诱导肝细胞，通过检测LPS刺激后肝细胞分泌TNF-α的含量，来验证肝损伤模型是否建立。由表2结果可知，与空白组相比较，LPS刺激后TNF-α的含量显著上升（P<005）。不同剂量组的AHP-Ⅱ均可使肝细胞损伤后的TNF-α含量下降（表2）。

2.3 不同浓度的AHP-Ⅱ对肝损伤后分泌ROS的影响

肝细胞增殖、静息的相互转变一旦失控，会对肝脏正常发育、肝再生甚至肝癌发生等造成重大影响。目前的研究表明活性氧（ROS）可在细胞增殖过程中发挥双向调节作用，高水平ROS诱导细胞凋亡、坏死，低水平ROS诱导细胞增殖。流式实验结果显示，LPS模型组与空白组相比，ROS的含量显著升高。

2.4 AHP-Ⅱ对JNK信号通路的影响

本研究发现，JNK信号通路与肝脏疾病关系密切，多种肝脏应激与损伤均存在JNK信号通路的激活。本次实验结果显示，LPS组与空白组相比，有显著性差异。

3 讨论

爆发性肝衰竭是急性肝损伤的致命并发症，具有预后差死亡率高的特点。在发展中国家，病毒感染是导致爆发性肝衰竭最常见的原因，然而在西方国家，药物诱发的急性肝损伤已成为FHF的主要病因。涉及病原体诱导FHF的机制有两方面，一方面，病原体直接破坏肝细胞的结构和细胞器，触发细胞信号级联反应，导致细胞结构和功能的紊乱，然后诱导细胞凋亡和坏死。另一方面，受损的肝细胞释放内源性损伤相关分子模式（DAMPS），激活了自身免疫系统，刺激免疫细胞释放炎症因子，这又加重了肝细胞的损伤最终导致爆发性肝衰竭。尽管在FHF的发病机制和诊断上已经取得了很大进展，目前却尚无有效的治疗方法。目前FHF可用的治疗方法是肝移植，但由于缺乏捐献者的肝脏而受到限制。因此越来越多的研究人员专注于寻找更有效的治疗FHF的药物（Sultan et al.， 2017）。

目前已知的黄酮类（水飞蓟素，黄芩苷，槲皮素）（张强等，2014 ;张立海和慈慧，2012;翁书强等，2015）、萜类化合物（穿心莲内酯，白桦脂酸）（王雷，2016;徐立新和严丽军，2017）、生物碱（苦参碱）（高艳等，2013）、多酚类（苦丁茶多酚）（赵欣等，2017）、多糖类（当归多糖，枸杞多糖）（宋之臻，2016;章培军等，2011），都具有保肝降酶的功效。为了开发现有中药的更大价值，我们提取了红毛五加多糖AHP-Ⅱ，同时结合大鼠肝细胞培养技术，用脂多糖（LPS）离体攻击的免疫手段，构建了在病理生理机制上和人类肝损伤接近的免疫性肝损伤体外模型，来探究红毛五加多糖对免疫性肝损伤的保护作用。

現有的关于五加科多糖的护肝作用大多集中在酒精性肝损伤和化学性肝损伤上，关于免疫性肝损伤的研究少有报道。卢芳等（2016）发现刺五加多糖通过半胱氨酸和蛋氨酸代谢、胆汁的分泌、柠檬酸循环等代谢通路发挥肝损伤的保护作用;张正光等（2011）发现细柱五加果实乙醇提取物通过降低血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶CAST）的活性及肝组织中丙二醛（MDA）的含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性来发挥对化学性肝损伤的保护作用;郝乘仪等（2012）发现刺五加酸（AA） 通过升高丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（ AST）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的活力、抑制小鼠肝细胞DNA的损伤来发挥对酒精性肝损伤的保护作用;鞠洋等（2005）发现红毛五加多糖通过降低过高的NO含量来发挥肝保护作用。

LPS能够触发许多的病理学事件，包括炎症细胞因子的产生，例如TNF-α。TNF-α能够介导肝细胞的坏死，产生其他细胞因子，例如IL-1B、IL-6，在肝损伤的发病机制中具有重要作用，而抑制TNF-α的表达能够减轻肝损伤。本研究发现，在用LPS处理后，肝细胞内TNF-α水平显著上升，这表明LPS可以诱导肝损伤模型。同时，也发现，AHP-Ⅱ可以显著降低炎症细胞因子的水平，使其恢复到正常水平，这一结果表明，AHP-Ⅱ可能通过其抗炎作用发挥保护肝脏的作用。ROS参与肝硬化的发病机制，也是肝癌的危险因素，中、高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。 本研究从肝损伤后ROS水平的变化关系入手，来探讨AHP-Ⅱ对于肝损伤过程中的关键作用。本研究表明，LPS刺激肝细胞后，细胞中ROS的水平显著上升，而用AHP-Ⅱ处理后，ROS的水平显著降低，这说明AHP-Ⅱ可能通过其抗氧化作用发挥保护肝脏的作用。

MAPK信号通路参与免疫应答，调节炎症反应，参与细胞生长、发育、凋亡等多种病理、生理过程。然而关于LPS诱导的免疫性肝损伤中MAPK信号通路的研究还少有报道（王凤华等，2017;田静等，2016;朱瑞芳等，2006）。JNK的活化具有双向调节的作用，JNK过度激活会诱导细胞凋亡通路，低表达则会满足细胞的正常分化增殖等生长活动。因此无论是肝细胞炎症还是死亡，JNK在多种肝脏应激与损伤中起着重要的调节作用。为了进一步探究AHP-Ⅱ对于LPS诱导的肝损伤的保护作用的机制，我们检测了JNK2磷酸化的情况，结果发现，LPS可通过促进JNK2蛋白磷酸化来诱导肝细胞损伤，而中高浓度的AHP-Ⅱ可通过抑制JNK2蛋白磷酸化来抑制炎症反应。综上所述，红毛五加多糖AHP-Ⅱ可以通过降低JNK的磷酸化蛋白含量来抑制炎症因子TNF-α及ROS的水平进而发挥免疫保护作用。

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