铜胁迫对甘蔗生长及抗氧化酶活性的影响

曾巧英 凌秋平 杨湛端 刘睿 吴嘉云 齐永文

摘 要： 甘蔗是重要的糖能兼用植物，同時也是潜在的重金属土壤修复植物。为了探明甘蔗对铜胁迫的生理响应，该研究采用营养液培养的方法分析了铜胁迫对甘蔗生长、叶片相对电导率、叶绿素含量及根系抗氧化酶活性等的影响。结果表明：甘蔗地上部分生物、叶绿素含量随铜浓度增加而下降，地上部分铜含量和叶片的相对电导率则随铜浓度增加而提高。根系的丙二醛（MDA）含量在胁迫24 h开始发生显著的变化，在400 μmol·L-1铜处理下比对照显著增加了25.5%，随着胁迫时间的延长，丙二醛含量增加幅度上升。到胁迫72 h，100 μmol·L-1铜处理的MDA含量也显著的提高。根系SOD、POD和CAT酶活性在胁迫24 h开始发生显著的变化，但不同酶活性变化存在差异。SOD酶活性除了在胁迫的72 h随铜浓度增加而提高，其他时间表现为在100 μmol·L-1铜处理下活性下降，随着铜浓度继续增加SOD酶活性提高，到400 μmol·L-1铜处理SOD酶活性又出现下降。POD酶活性在处理的24、48和72 h表现为随浓度增加先提高后下降的趋势，但在处理7 d时随铜浓度增加而提高。CAT酶活性随着浓度的升高和胁迫时间的延长而下降，到了胁迫的第7天，三个铜处理下CAT酶活性分别下降了89.98%、96.88%和98.50%。由此可见，铜胁迫严重影响甘蔗的生长，较短时间的处理就已经引起了甘蔗根系的氧化胁迫，根系中SOD、POD和CAT酶活性的变化在甘蔗对抗铜引起的氧化胁迫中起到重要作用。

关键词： 甘蔗， 铜处理， 相对电导率， 叶绿素， 氧化胁迫

中图分类号： Q945  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2019）07-0951-08

Abstract： Sugarcane is the most important sugar and energy crop. It is also the potential plant for remediation of high metal-polluted soil. To evaluate the physiological response of sugarcane to copper （Cu） stress， the weight of sugarcane， content of chlorophyll， relative electrical conductivity in leaves and activities of antioxidant enzymes in roots were examined by hydroponics. The results revealed that the growth of sugarcane inhibited by Cu stress. The weight of shoot and content of chlorophyll decreased with the increase of Cu content in nutrient solution， while the copper content in shoot and relative electrical conductivity in leaves increased in response to copper stress. The malonaldehyde （MDA） content was increased significantly by 25.5% under 400 μmol·L-1 treatment at 24 h when compared with the control， and then the rate increase raised with the prolonging of treatment time. The MDA content increased notably after 72 h under 100 μmol·L-1 Cu treatment. The activities of SOD， POD and CAT changed significantly after 24 h treatment， but notable differences were found among different enzymes. The activities of SOD firstly dropped under 100 μmol·L-1 treatment， and then increased with the increase of Cu content in solution under 200 μmol·L-1 treatment， following with decrease of enzyme activities under 400 μmol·L-1 treatment at 24 h， 48 h and 7 d. However， the activities of SOD increased with the increase of Cu content in solution at 72 h. The activities of POD increased with the increase of Cu content in solution， following with decline of enzyme activities under high content of Cu treatment at 24， 48 and 7 h except at 72 d. The activities of CAT decreased significantly with the increase of Cu content in solution and with the prolonging of stress time. The activities of CAT declined by 89.98%， 96.88% and 98.50% under three Cu treatments， respectively on the seventh day. Thus， the growth of sugarcane was greatly inhibited by copper stress and the change of SOD， POD and CAT activities might play an important role in alleviating oxidative stress caused by Cu stress.

Key words： sugarcane， copper treatment， relative electrical conductivity， chlorophyll， oxidative stress

随着采矿业、工业的废水等的排放、含重金属农药化肥的大量使用，土壤重金属污染日趋严重，其中铜是土壤主要污染物之一（金勇等，2012）。铜在植物体内参与许多生理代谢过程，是植物必需的重要元素之一。但是，植物体内积累的铜超过一定限度，会对植物造成毒害，影响植物的叶绿素合成、光合作用、细胞膜透性、营养元素的吸收转运等，最终导致植物生长的抑制（胡筑兵等，2006;赵雪芹等，2012;丁佳红等，2013）。现有的研究显示，过量的铜进入细胞后，能直接或者间接影响植物体内活性氧（ROS）的平衡，导致膜质过氧化反应，损伤与破坏植物细胞膜（Ravet & Pilon，2013）。铜胁迫下，植物体内膜脂过氧化的产物丙二醛（MDA）含量显著升高（王晓维等，2014; 赵庆芳等，2017）。植物体内的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等在清除活性氧，保护植物免受氧化损伤中起着重要作用（Bhaduri & Fulekar，2012）。对玉米的研究显示，玉米叶和根中的SOD、POD、CAT活性均随着Cu2+浓度的增加而提高，仅CAT活性在Cu2+浓度达到600 mg·kg-1时有所下降（王晓维等，2016），但是铜胁迫下不同作物抗氧化酶活性变化存在差异。烟草叶片中的SOD、POD和CAT三种抗氧化酶的活性均先上升后下降（葛淑芳等，2014），而在小麦种Cu胁迫下超氧化物歧化酶（SOD）活性呈升高的趋势，过氧化物酶（POD）活性呈先升高后下降的趋势（赵庆芳等，2017）。

在重金属污染土壤的治理中，植物修复以其简单、经济且环境友好等特点成为最具潜力的土壤重金属修复的方式（公勤等，2018）。甘蔗是重要的能源植物，具有高生物量、抗逆性强等特点。Sereno et al.（2007）的研究显示，在水培条件下浓度超过250 μmol·L-1的Cu2+对甘蔗生长有明显抑制作用。在盆栽条件下，甘蔗各部位铜浓度随外源添加铜量的增加而增加，少量添加铜（50 mg·kg-1）会使甘蔗明显增产，但是过量的铜对甘蔗的生长和生物量的影响不明显，表现出对Cu污染有较高的耐性（郭家文等，2010）。由此可见，甘蔗有潜力成为土壤铜污染修复的重要植物，但是对甘蔗铜胁迫下的生理响应，特别是抗氧化酶系统对重金属铜的响应研究较少。因此，本研究以优异的甘蔗品种为材料，在水培条件下分析铜胁迫对甘蔗叶片膜透性及根系抗氧化酶活性的影响，以期为进一步探讨铜污染下甘蔗的耐性机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究選取大面积推广的甘蔗栽培品种ROC22为材料，试验材料采自广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）的资源保育圃。

1.2 方法

选取生长一致的甘蔗种茎，将种茎砍成单芽，用5%的多菌灵浸泡30 min;将种茎置于装有石英石的育苗盘中，在玻璃温室中育苗;待幼苗长出4片叶片时，选取生长一致的幼苗移入10 L的塑料盆中进行培养，每盆加入10 L的营养液。营养液采用改良的Magnavaca营养液（Famoso et al.，2010）。营养液含1.5 mmol·L-1 NH4NO3、1 mmol·L-1 KCl、1 mmol·L-1 CaCl2、0.5 mmol·L-1 Mg（NO3）2、0.155 mmol·L-1 MgCl2、0.045 mmol·L-1 KH2PO4、1.643 mmol·L-1 MgSO4、11.8 μmol·L-1 MnCl2、0.61 μmol·L-1 （NH4）6Mo7O24、33 μmol·L-1 H3BO3、3.06 μmol·L-1 ZnSO4、0.8 μmol·L-1 CuSO4和0.077 mmol·L-1 FeSO4。待幼苗上的苗根长出，去除种茎，继续培养一周，使得根系生长状况良好，进行铜处理。铜处理的浓度设置为0、100、200、400 μmol·L-1的CuSO4，pH6.0，设4次重复，在处理的24 h、48 h、72 h和7 d取根系样品测定抗氧化酶活性和丙二醛含量，并在处理7 d取样测定叶片相对电导率，叶绿素含量，地上部分收获后，70 ℃烘干称取干重。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 铜含量的测定 烘干的植株样品用植物粉碎机粉碎并过20目筛子，称取1 g的样品，采用HNO3-HClO4（4∶1）消解，消解后样品定容到50 mL，采用原子吸收分光光度计（AA-7000，岛津，日本）测定样品中的铜含量。

叶绿素含量测定采用乙醇提取比色法（陈建勋和王晓峰，2006）;相对电导率测定参照汤章城（1999）的方法进行;根系丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸比色法（汤章城，1999）。

1.3.2 抗氧化酶活性测定 每个处理取5条完整的根混合测根系的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性，设3次重复。抗氧化酶的提取及活性测定方法参照Li et al.（2013）的方法，并做修改。抗氧化酶提取液为50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.0，内含1 mmol·L-1 EDTA、1 mmol·L-1 ASA、1 mmol·L-1 DTT、1 mmol·L-1 GSH、5 mmol·L-1 MgCl2和20%甘油），样品用液氮研磨后，准确称取约0.2 g样品，加入2 mL的提取液，在4 ℃下12 000 r·min-1离心30 min，取上清液分装，用液氮冷冻后保存在-80 ℃，用于酶活性的测定。

所有酶活性测定均采用紫外可见分光光度计（UV-1800，上海菁华，中国）测定。各酶活性均取50 μL的粗酶液进行酶活性的测定。SOD酶活性利用SOD对氮蓝四唑（NBT）的光抑制作用来测定，一个单位的SOD酶活定义为50%抑制NBT减少需要的酶量来表示;POD酶活性测定3 min的OD470变化，酶活性以单位时间OD470的减少量来表示;CAT酶活性测定3 min的OD240的减少量，酶活性以单位时间OD240的减少量来表示。所有酶活性最终都换算成单位鲜重的酶活性。

1.4 数据统计方法

所有数据的处理、方差分析及图表的制作采用Excel2010和DPS7.05软件进行，多重比较采用LSD方法。

2 结果与分析

2.1 铜胁迫对甘蔗生物量和叶片相对电导率的影响

铜胁迫7 d后，在铜浓度为100 μmol·L-1时，地上部分的生物量已经比对照显著下降了28.05%，而且随着浓度而增加，当浓度增加到400 μmol·L-1时生物量下降了37.67%，但与200 μmol·L-1时相比无显著差异。由此可见，铜胁迫严重影响到甘蔗生长，超过200 μmol·L-1甘蔗生长基本停止（图1：A）。铜胁迫下，地上部分的铜浓度显著增加，且随着浓度的增加，铜浓度升高。到400 μmol·L-1铜处理时，甘蔗地上部分的铜浓度是对照的15.93倍（图1：B）。低浓度铜胁迫（100 μmol·L-1）叶片的相对电导率仅升高了8.49%，但与对照并没有显著差异（图1：C）。随着铜胁迫浓度增加到200 μmol·L-1，叶片的相对电导率比对照提高了33.29%，显著高于对照。铜浓度增加到400 μmol·L-1时，相对电导率继续升高，比对照增加了61.51%，表现出甘蔗受到铜胁迫的伤害程度随铜浓度的增加而加重。

2.2 铜胁迫对甘蔗叶片叶绿素含量的影响

铜胁迫下甘蔗叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量下降，且随着铜浓度增加下降幅度也增加。到铜浓度为200 μmol·L-1时叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量最低，分别比对照减少了66.12%、75.98%和69.42%。但是随着胁迫浓度的进一步增加，到400 μmol·L-1时，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量又有所回升，比200 μmol·L-1时增加了47.85%、130.79%和69.65%，但仍然显著低于对照。

2.3 铜胁迫下甘蔗根系MDA含量变化

铜胁迫24 h对根系的MDA含量影响较小，仅400 μmol·L-1铜处理下MDA含量显著上升，比对照升高了25.5%，其他浓度下根系的MDA含量与对照无显著差异（图2）。随着处理时间的延长，到铜胁迫的48 h，低浓度铜胁迫（100 μmol·L-1）下MDA含量增加了13.31%，但是与对照没有显著差异，200 μmol·L-1处理时MDA含量显著上升，而且随在浓度的增加MDA含量升高。到胁迫的72 h，低浓度铜胁迫（100 μmol·L-1）的MDA含量也显著上升，两个高浓度铜胁迫间的MDA含量不存在差异。到胁迫的第7天，低浓度铜胁迫（100 μmol·L-1）下，根系生长得到一定程度的恢复，其MDA含量与对照没有显著差异，其他两个浓度下MDA含量随浓度的增加而增加。

2.4 铜胁迫对甘蔗根系SOD酶活性的影响

植物體内抗化氧化酶系统在植物对抗氧化胁迫中起重要的作用。甘蔗根系的SOD酶活性在24 h开始发生变化，在100 μmol·L-1处理下SOD酶活性显著下降，但是随着铜浓度增加到200 μmol·L-1时，SOD酶活性升高且显著高于对照，铜浓度增加到400 μmol·L-1时，SOD酶活性又出现了一定程度的下降，与对照没有差异（图3）。胁迫48 h时SOD酶活性的变化与24 h类似。胁迫72 h，SOD酶活性随着铜浓度的增加而增加，高浓度处理下的SOD酶活性显著高于对照。胁迫7 d，SOD酶活性变化与24 h类似，但各处理间的SOD酶活性没有显著的差异。

2.5 铜胁迫对甘蔗根系POD酶活性的影响

在铜胁迫24 h，POD酶活性显著上升，在铜浓度为200 μmol·L-1时POD酶活性达到最高，比对照提高了30.06%，但是随着铜浓度的继续升高，POD酶活性出现下降，仍然比对照显著提高14.14%（图4）。铜胁迫48 h，POD酶活性变化与24 h相似，但是在100 μmol·L-1和200 μmol·L-1两个处理间不存在显著的差异，而在高浓度（400 μmol·L-1）下POD酶活性比对照下降了5.14%，与对照没有显著差异。在胁迫的72 h，在100 μmol·L-1处理下POD酶活性达到最高，显著高于对照，其他两个铜处理与对照没有显著差异。在铜处理的7 d，根系的POD酶活性随浓度增加而提高，但三个铜处理间酶活性并不存在显著的差异。

2.6 铜胁迫对甘蔗根系CAT酶活性的影响

甘蔗根系CAT酶活性在处理的4个时间点均表现出随着铜浓度的升高，CAT酶活性显著降低，而且随着处理时间的延长，CAT酶活性下降的幅度增加（图5）。处理的24 h，CAT酶活性在三个铜浓度下分别下降了25.66%、36.97%和72.68%，高浓度铜胁迫（400 μmol·L-1）与另外两个处理间存在显著差异。到了胁迫的第7天，三个铜处理下CAT酶活性分别下降了89.98%、96.88%和98.50%，且三个铜处理间没有显著的差异。由此可见，甘蔗中CAT酶活性对铜胁迫非常敏感，过量的铜积累显著的抑制根系中CAT酶活性，并且这种抑制随着胁迫时间而增强。

3 讨论

铜作为植物必需元素之一，一定量的铜对植物生长具有促进作用，过量的铜就会对植物生长产生抑制作用。本研究同样显示，铜胁迫显著抑制甘蔗的生长。但与Sereno et al.（2007）和郭家文等（2010）的结果有所不同，本研究中，在铜浓度100 μmol·L-1时就已经对甘蔗生长造成了抑制，生物量显著下降，植株地上部分铜含量显著升高，尽管叶片的相对电导率并没有表现出明显的下降，但是叶片的叶绿素含量已经表现出明显的下降。过量铜存在的情况下，会造成叶绿体酶活性比例失调，叶绿素快速分解，同时影响叶绿素合成途径酶活性，抑制植物叶绿素的合成，使得叶绿素含量降低（Lou et al.，2004;王穗子等，2015）。在对玉米、小麦等作物的研究中也同样显示铜胁迫下叶片叶绿素含量的下降（胡筑兵等，2006;彭向永和宋敏，2011）。甘蔗生长对不同浓度铜响应与前人结果不一致的原因可能是由于甘蔗品种的差异或者胁迫处理方式的不同造成。另外，本研究中显示，在高浓度铜的情况下，叶绿素有所上升，这可能是由于高浓度铜胁迫对根系生长造成伤害导致地上部分无法获得水分，叶片快速失水萎蔫，叶片的快速萎蔫一方面使得叶片中分解叶绿素酶活性下降，另一方面也使得其实际取的样品量要高于其他处理。

植物细胞原生质膜在维持胞内外离子平衡和物质的主动运输中起着重要作用，铜胁迫条件下，随着浓度的增加植物细胞膜透性也增加，因此被认为是评价植物对铜胁迫的方法之一（刘鹏等，2009）。本研究中，铜胁迫下甘蔗叶片的相对电导率随着铜浓度的增加而增加。虽然本研究仅测定了甘蔗胁迫7 d后的叶片的相对电导率，但是在高浓度铜胁迫下，24 h开始已经出现了轻度的萎蔫，说明铜早期已经开始对甘蔗造成毒害。根系是植物吸收养分和水分的器官，过量的铜进入植物体首先是对根系造成伤害，影响到植物根系對养分和水分等的吸收（刘鹏等，2009）。本研究的根系丙二醛含量在高浓度铜胁迫24 h后就开始显著上升，说明根系在胁迫早期已经开始受到铜胁迫伤害。随着根系细胞的膜脂过氧化程度加深，影响甘蔗根系的正常生理代谢，包括根系对水分的吸收，造成植物地上部分失水，最终表现为叶片的相对电导率升高。

植物体内的抗氧化酶通常协同参与植物体内活性氧的清除。一般情况下首先由SOD酶将活性更强的超氧化离子（O-2 · ）歧化为活性更弱的H2O2，随后H2O2被APX、POD或（和）CAT在细胞质或其他细胞器中酶分解为水和氧气（Bhaduri & Fulekar，2012）。植物中有关抗氧化酶在提高植物耐铜胁迫能力的研究显示，提高抗氧化酶活性，降低氧化胁迫的影响是水杨酸、海藻糖、ABA等物质缓解铜对植物毒害的主要因素（Mostofa et al.，2015;丁佳红等，2013;李雪等，2016）。本研究中，SOD、POD和CAT酶活性在铜胁迫24 h开始出现了改变。SOD酶活性在大部分时间点（除72 h外）表现为在低浓度条件下（100 μmol·L-1）显著下降，这说明低浓度铜胁迫可能抑制了SOD酶的活性，并且在此浓度下植物的氧化胁迫较轻，产生的O-2 · 的量较少，但是随着浓度的升高，铜诱导的氧化胁迫加剧，SOD酶活性出现了上升，以清除较多O-2 · 。这个结果与根系中MDA含量的变化相符合，在低浓度条件下（除了72 h）MDA含量与对照没有显著差异，随着浓度的升高MDA含量显著上升（薛盈文等，2016）。POD酶活性在低浓度条件下显著提高，到200 μmol·L-1活性的继续升高，与此时的SOD活性的变化相一致，POD酶活性的提高有助于清除铜诱导产生H2O2，降低ROS对甘蔗生长的影响。高浓度（400 μmol·L-1）的铜对SOD酶和POD酶活性的抑制与其他植物的研究结果类似（葛淑芳等，2014）。CAT酶活性则随铜浓度的增加而持续下降，与小麦根系CAT酶对铜响应类似（赵庆芳等，2017）。这个现象可能归因于CAT酶参与清除铜诱导产生H2O2，或者CAT合成途径可能受到铜诱导的氧化胁迫抑制（Cao et al.，2017）

铜是植物的必需元素，但过量的铜严重抑制甘蔗生长，导致甘蔗生物量、叶片叶绿素含量下降，铜含量和叶片相对电导率升高，而且随着铜浓度的增加抑制加剧。甘蔗根系的MDA含量24 h开始出现上升，随浓度增加丙二醛含量增加，说明铜胁迫下根系受到氧化胁迫。根系中的抗氧化酶SOD、POD和CAT随胁迫浓度和胁迫时间发生改变，这些酶活性的改变对甘蔗根系抵抗氧化胁迫具有重要意义。

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