樟叶越桔组培苗生根和移栽技术研究

赵展平 何芳 唐军荣 罗旭璐 赵平 黄荐 丁勇

摘 要： 為解决樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）组培苗生根质量不佳、移栽成活率低的问题，该研究以樟叶越桔继代苗为材料，采用单因子试验从激素类型及浓度、培养基类型和蔗糖质量浓度对其生根的适宜条件进行筛选，进一步研究了不同基质配比对樟叶越桔移栽苗存活率的影响。结果表明：激素类型和浓度、培养基类型对樟叶越桔生根率的影响最大，其次为蔗糖质量浓度;最适合樟叶越桔生根的激素及浓度为IBA 2.0 mg·L-1、基本培养基类型为1/4MS、蔗糖质量浓度为15 g·L-1，樟叶越桔组培苗最佳生根培养基为1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率达100%，平均生根数为每株7.67条;根系呈辐射状、基部无愈伤组织，组培苗生长健壮、叶色浓绿;樟叶越桔组培苗移栽时以全腐殖土基质为佳，成活率为83.7%，植株叶片舒展，生长状况良好。该研究建立的优化体系有效地提高了樟叶越桔组培生根苗的生根率和生根质量，解决了后期移栽成活困难的问题，为优良的樟叶越桔植株规模化生产提供了科学依据和技术支持。

关键词： 樟叶越桔， 激素， 生根， 移栽， 组培苗

中图分类号： Q943.1  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2019）07-0967-09

Abstract： Vaccinium dunalianum is one of the main plant sources for arbutin which is widely used in cosmetic formulations as the natural active agents to whiten the skin. During the tissue culture process of V. dunalianum， the base of the rooting plantlets obtained by the current culture medium often formed the callus， which significantly affected the survival rate after transplantation. In order to improve the rooting quality of the proliferation plantlets and survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum. The optimum medium components for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum， including hormone types and concentrations， medium types and sucrose concentrations， were analyzed by the single factor experiment， and further probed the effects of different substrate ratios on the survival rate of the transplanted V. dunalianum plantlets in this study. The results showed that the medium types and the hormone types and their concentrations had more significant effects on the rooting rate than sucrose concentration. For the root induction， the optimal hormone and its concentration were IBA 2.0 mg·L-1， the optimal media was 1/4MS and the optimal sucrose concentration was 15 g·L-1. The most suitable medium for the root induction of the proliferation plantlets of V. dunalianum was 1/4MS+ IBA 2.0 mg·L-1+ activated carbon 0.1 mg·L-1+ sucrose 15 g·L-1， by which the rooting rate could reach 100%， and the average number of roots was 7.67 per plant. The root system of proliferation plantlets of V. dunalianum was radially extended and none callus was formed at the base of the rooting plantlets. In addition， the tissue culture plantlets of V. dunalianum grew strong and had dark-green leaves. For the transplantation of V. dunalianum plantlets， the optimal media for transplantation was the 100% humus， in which the survival rate reached 83.7%， and the tissue culture plantlets obtained by the experiments grew well and had healthy leaves. The optimization system established by this study， which had effectively improved the roots quality and rooting rate of the proliferation plantlets and the survival rate of the transplanted plantlets of V. dunalianum， and provided scientific and technological support for the large-scale production of high quality V. dunalianum plants.

Key words： Vaccinium dunalianum， hormone， rooting， transplanting， tissue culture plantlet

樟叶越桔（Vaccinium dunalianum）又名饭米果、长尾越桔，为杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）植物，多年生常绿灌木，生于山坡灌丛、阔叶林下或石灰山灌丛，稀附生常绿阔叶林中树上，偶成乔木，全株可药用，具有祛风除湿、舒筋活络等功效，我国主产于云南、四川、贵州、西藏等地（方瑞征，1986）。本课题组研究发现樟叶越桔是一种富含熊果苷和咖啡酰熊果苷类物质的特殊民族资源植物，是广泛应用于化妆品行业的皮肤美白天然活性剂原料熊果苷的主要植物来源之一（Zhao et al.，2008）。樟叶越桔幼嫩叶芽经过一系列工艺后在云南彝族民间作为茶代用品饮用，因形似雀嘴呈锥状，又称“雀嘴茶”，研究发现“雀嘴茶”和樟叶越桔阴干果实中氨基酸种类齐全，含量丰富，且含有丰富的矿质元素和营养素，有较高的营养和保健价值（杨芳等，2011;罗旭璐等，2014b）。樟叶越桔花冠淡绿带紫红色或淡红色，还具有一定的观赏价值，园林上可用于丛植或行道树（王丽娜， 2010），同时在城市绿化上也有广阔的应用前景。

樟叶越桔目前仍处于野生状态，加上其原生环境遭受严重破坏、植株生长缓慢，导致樟叶越桔野生资源日益匮乏，其种质资源保护利用与优良种繁育技术亟待开发。常用的林木种苗繁殖方式包括种子繁殖、扦插繁殖和组培繁殖等。有研究者以野生樟叶越桔种子为材料，研究了不同处理方法对樟叶越桔种子萌发的影响，发现樟叶越桔种子萌发率均低于70%（任国香等，2017），同时由于缺乏樟叶越桔优良家系，种子繁殖易出现性状分离。采用传统的扦插繁殖技术开展樟叶越桔种苗繁育也存在需穗条多、对母株伤害大、繁殖速度慢等缺点。然而，组培快繁技术则是一种有效的樟叶越桔植物资源开发和保护技术。当前，国内外对越桔属多种植物的组培快繁技术研究已有报道，使用组培快繁技术可使蓝莓茎段成活率高达85.7%，愈伤组织诱导率可达88%（房小晶等，2014）;和加卫和徐中志（2007）以云南越桔继代培养的芽苗转接于生根培养基中，生根率达78%，炼苗成活率在90%以上。目前，本课题组已就樟叶越桔的组织培养研究开展了一定的基础工作，一方面以野生樟叶越桔幼嫩带芽茎段为外植体，建立了樟叶越桔的组织培养与快速繁殖体系，外植体诱导萌发率为83.33%，生根率为86.67%（罗旭璐等，2014a）;另一方面以樟叶越桔组培苗叶片为研究材料，建立了樟叶越桔叶片诱导不定根的培养体系，并试图通过定向培养植物细胞或组织来获取熊果苷和咖啡酰熊果苷类物质等活性次生代谢产物（卜程洪等，2018）。但还没有开展樟叶越桔生根苗的移栽炼苗研究。同时前期研究发现樟叶越桔继代培养苗转接于生根培养基中，虽然生根率超过了85%，但并未达到最佳;同时，现有生根配方获得的组培生根苗基部还存在大量愈伤组织，导致移栽成活率低。

组培生根苗的质量直接会影响到移栽苗的成活率，进而决定种苗的培育成本，因此采用植物组织培养技术进行种苗生产，首先要有完整的组培工艺流程，其次要不断优化工艺流程，以不断降低生产成本。基于此，为了进一步完善樟叶越桔的组培快繁工艺流程，降低育苗成本，推进种苗的工厂化生产进程。本试验在前期研究基础上，以樟叶越桔继代苗为材料，从生根激素类型及浓度的比较、基本生根培养基的筛选、糖分浓度的筛选和移栽基质配比的筛选开展了研究，旨在提高樟叶越桔组培苗生根率、生根质量以及移栽成活率，降低生产成本，为樟叶越桔的优良植株的繁育和规模化生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 植物材料

以云南省武定县产野生樟叶越桔离体培养后的继代苗为试验材料，由西南林业大学国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室培育。

1.2 试验方法

1.2.1 材料的预处理 将樟叶越桔丛生芽转接在1/2MS + IAA 1.5 mg·L-1+ 活性炭0.1 g·L-1 + 蔗糖20 g·L-1 + 琼脂5 g·L-1的培养基中进行壮苗处理2个月，获得壮苗后的樟叶越桔继代苗，并去除分裂素的影响，再挑选叶色浓绿、生长健壮、无污染的继代苗接种在后续生根培养基上。培养基pH值为5.8～6.0;培养温度为（25 ± 2）℃，光照强度3 000 lx，每天光照12 h;50 d后统计生根率;试验于西南林业大学云南省高校林木生物技术重点实验室进行。

1.2.2 不同激素类型及浓度对樟叶越桔组培苗生根的影响 以1/2MS + 琼脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1+ 蔗糖15 g·L-1为基础培养基，设IBA（1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1），NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1），IAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1）共12个处理，同时设置不加激素的空白对照组。每组处理30瓶，每瓶10颗苗，重复3次。

1.2.3 不同培养基对樟叶越桔组培苗生根的影响 设置了5种不同的培养基类型，分别为MS、1/2MS、1/4MS、1/8MS、WPM，其他添加成分有IBA 2.0 mg·L-1、琼脂5 g·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1、蔗糖15 g·L-1。每组处理30瓶，每瓶10颗苗，重复3次。

1.2.4 不同糖分含量对樟叶越桔组培苗生根的影响 以1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1+ 琼脂5 g·L-1+ 活性炭0.1 mg·L-1为基础培养基，设置了4种蔗糖濃度，分别为5、15、25、35 g·L-1。每组处理30瓶，每瓶10颗苗，重复3次。

1.2.5 不同基质配比对樟叶越桔组培苗移栽成活的影响 将生根培养基上植株健壮，叶片舒展，根系发达的生根苗放置移栽环境中闭瓶处理7 d后，从培养瓶小心取出并冲洗残留培养基，移栽至炼苗基质中。炼苗移栽基质设全腐殖土、红壤∶腐殖土（1∶1）、红壤∶腐殖土（2∶1）、红壤∶腐殖土（4∶1）共4个处理，每个处理均全面喷洒多菌灵，浇透水后第2天进行移栽，期间保证其空气温度不高于30 ℃，每个处理移栽50株樟叶越桔生根苗，重复3次，3个月后统计其成活率。

1.3 数据分析

采用Excel 2007和SPSS 19.0软件统计试验数据并进行显著性分析。按照下列公式计算生根率和成活率：

生根率=（生根苗数/接种的总苗数）×100%;

成活率=（移栽后成活苗数/移栽总苗数）×100%。

根据观察根系发达、粗壮的程度把组培苗生根状况描述为生根良好、生根较好、生根较差和生根差四个等级，表中“生根良好”记为“++++”，“生根较好”记为“+++”，“生根较差”记为“++”，“生根差”记为“+”。

2 结果与分析

2.1 不同激素类型及浓度对樟叶越桔组培苗生根影响

从表1可以看出，对照组的组培苗未生根，不同IAA浓度处理的组培苗生根效果有差异但不显著，根的数量少，基部少量愈伤组织，其最高生根率为73.33%。不同浓度NAA处理下的组培苗生根率在随着NAA浓度的增加逐渐提高，在NAA 2.0 mg·L-1处理下生根率达到80.00%，根系也随之变得发达、粗壮，但根的数量少，基部有大量愈伤组织。不同浓度IBA处理的组培苗生根效果呈现显著差异，随着IBA浓度的升高，组培苗生根率呈现先升高再下降的趋势，在IBA 2.0 mg·L-1处理下其生根率达到最高，为81.67%，樟叶越桔的生根效果也最佳，根系发达、粗壮，呈辐射状，基部无愈伤组织，植株叶片舒展（图1，图2）。

2.2 不同培养基对樟叶越桔组培苗生根影响

从表2可以看出，不同培养基处理的樟叶越桔组培苗生根率存在显著性差异。其中：1/4MS培养基处理的组培苗生根率最高（达97.22%），根系数量多且粗壮，植株生长健壮（图3，图4）;其次是1/2MS的培养基，生根率达到81.67%，生根数量也较多，植株生长也较好。其他培养基处理的组培苗根系则较细、生根率较低、植株生长较弱。

2.3 不同糖分浓度对樟叶越桔组培苗生根影响

从表3可以看出，添加5～35 g·L-1蔗糖后，各处理组生根率均较高，其中蔗糖15 g·L-1处理下的组培苗生根率最高（达到100%），而且根数量也最多，长度最长，呈辐射状，苗生长健壮，叶色浓绿（图5，图6）。

2.4 不同基质配比对樟叶越桔组培苗移栽成活影响

从表4可以看出，把樟叶越桔生根苗移栽入不同基质进行移栽驯化，发现移栽成活率随着红土比值的加大而逐渐降低，长势也越来越差。最适的基质为全腐殖土，成活率最高（达到83.7%），且叶片舒展，生长状况良好（图7）。

3 讨论与结论

本研究通过分析不同激素类型及浓度、培养基类型和糖质量浓度等因素对樟叶越桔组培苗生根的诱导影响，获得樟叶越桔理想的生根培养基配方为1/4MS + IBA 2.0 mg·L-1 + 活性炭0.1 mg·L-1 + 蔗糖15 g·L-1，生根率最高可达100%;并进一步研究了不同基质配比对樟叶越桔移栽苗存活率的影响，得出樟叶越桔组培苗移栽时以全腐殖土基质为佳，成活率达83.7%。

在植物组培快繁过程中，组培苗的生根及炼苗移栽是该工艺流程中最后两个核心环节。生根苗质量的好坏直接影响到后期的炼苗移栽，而移栽成活率的高低则直接影响組培快繁的生产成本。在组培苗的生根过程中，激素的类型及浓度对根系的形成最为关键。Ikeuchi et al.（2016）研究发现，植物能够再生缺失的组织和器官，通过激素诱导可加快再生进程。生长素对不定根的诱导效果在不同的植物中表现不同（Abdulaziz & Bahrany，2002）。生长素IBA和NAA对不定根的诱导比生长素IAA要稳定（AI-Juboory et al.，1998），有研究证明在多种植物中IBA对不定根的诱导作用效果较好（Prakash et al.，1999;Rani & Grover，1999;Fracro & Echeverrigaray，2001）。本研究比较了一定浓度范围内的IAA、NAA和IBA三种激素对樟叶越桔组培苗生根的影响，结果表明IAA和NAA处理的樟叶越桔生根苗基部会存在大量愈伤组织，而IBA处理的樟叶越桔生根苗基部无愈伤组织，生根质量好，且生根率有随着IBA浓度的升高先增加达到峰值后再降低的变化规律，这与野含笑（曹基武等，2015）、蓝莓（韩德伟，2013）和笃斯越橘（王振武等，2015）等植物的变化规律类似。本研究表明IBA浓度为2.0 mg·L-1时，樟叶越桔组培苗生根率最高且根系发达，该IBA最适浓度高于前期课题组诱导樟叶越桔叶片产生不定根的IBA最适浓度1.0 mg·L-1 IBA（卜程洪等，2018），推测樟叶越桔组培苗的茎和叶片响应IBA诱导生根的敏感度存在一定的差异。另外，本试验只研究了不同单一激素及浓度对樟叶越桔组培苗生根的影响，为了降低樟叶越桔组培快繁生产成本，进一步提高组培苗的生根质量，后续可从多种激素组合及其浓度对樟叶越桔组培苗生根的影响开展深入研究。

大量元素在对植物的生长发育有着极其重要的作用，除氮元素外，磷、钾、钙、镁等元素都对植物细胞酶活性有一定影响，在植物新陈代谢过程中起着重要作用。程磊和胡宋英（2003）研究发现，低浓度的Ca2+和Mg2+有助于诱导根的形成和生长。本研究结果表明1/4MS培养基处理的樟叶越桔组培苗生根率高、生根效果最好，MS培养基处理下的樟叶越桔组培苗不生根，推测是高浓度的大量元素（如Ca2+和Mg2+）对樟叶越桔组培苗生根有抑制作用。郑小江和刘金龙（2001）在对天师栗茎芽组织培养研究中，也发现高浓度的无机盐对生根有明显的抑制作用。而1/8MS培养基较1/4MS培养基处理下的樟叶越桔组培苗生根率又有所下降，推测过低浓度的大量元素又无法满足组培苗生根的营养需求，这与刘正娥等（2012）的研究结果类似。前期罗旭璐等（2014a）研究结果发现WPM是最适宜培养基，生根率为86.67%，而本研究结果显示WPM培养基处理下的樟叶越桔组培苗生根率只有12.78%，且其根系生长差，原因可能与本研究中樟叶越桔组培苗生根处理前进行的壮苗处理有关，其中的内在机理还需要进一步深入研究。

糖作为组培苗生命活动的碳源和能源物质，同时具有调节渗透压和提高植物耐盐性的作用（刘丽萍，2006;龚建英，2019）。蔗糖在植物组织培养中得到了广泛的应用，既可为植物生长提供能源，又可促进植物组织分化。有研究发现蔗糖对植物根的生长有一定的调节作用，严华兵等（2011）发现高蔗糖浓度能促进不定根的发生，张硕等（2012）却发现蔗糖对小麦根的生长具有抑制作用，而De Faria et al.（2004）研究则表明不同蔗糖浓度对体外培养的石斛生根影响较小。本研究结果显示不同蔗糖浓度处理的樟叶越桔组培苗生根率均高于85%，表明蔗糖浓度对樟叶越桔组培苗生根的影响较小。可见，蔗糖对植物组培苗根的生长影响因物种不同而不同。研究还发现在培养基中加入适量的活性炭，既可吸附植物细胞分泌的毒性物质以及培养基中有毒副作用的物质，也可为根的生长营造近似自然生长条件下的暗环境，因此，在生根培养基中添加活性炭可有利于生根（刘根林等，2001;张文泉等，2015;冯汉青等，2016）。

越桔属植物根系较弱，没有侧根，组培苗移栽阶段较难成活（梁晓晶等，2011），因此對基质的要求也较高。在组培苗移栽过程中，基质起着支持和固定植物的作用，为植物提供相对适宜的生长环境。不同基质的保湿性、透气性和抗菌性等能力不同。樟叶越桔与蓝莓（董朝莉，2011）、蔓越橘（张丽华，2012）、红豆越橘（田新华等，2015）等同为越桔属植物，比较适合生长在疏松多孔、富含有机质、酸性的人工基质中。试验结果表明，采用全腐殖土处理的樟叶越桔组培苗移栽效果最好，炼苗成活率达83.7%，推测全腐殖土富含有机质且土质疏松透气，利于植物幼苗生长。此外，由于试管苗从高湿恒温的无菌环境转移到低湿变温的有菌环境，适应能力较弱（黄卓忠和严华兵，2007），因此，对环境的要求非常严苛，除对选用的移栽基质采取常规消毒处理外，移栽后的管护同样尤为重要，严格控制好温湿度，否则极易造成移栽苗死亡。

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