万寿菊雄性不育系离体快繁体系的建立

吴丽芳 赵艳 廖春方 钱绍方 桂宝林

摘要：【目的】建立色素万寿菊雄性不育系离体快繁体系，为开展万寿菊育种研究和杂交制种打下基础。【方法】以4个色素万寿菊母本资源（B1-1、B1-3、B1-4和Bnm）雄性不育株的叶片和茎段为外植体，以不同生长调节剂组合对其进行愈伤组织诱导、不定芽分化及生根培养，建立适宜色素万寿菊离体快繁的技术体系。【结果】以叶片为外植体的各色素万寿菊雄性不育株再生能力均较以茎段为外植体的再生能力强，其愈伤组织诱导率和不定芽分化率排序均为B1-3>B1-1>Bnm>B1-4;适宜B1-3和B1-1叶片愈伤组织诱导的培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），诱导率分别为99.2%和95.3%;适宜茎段愈伤组织诱导的培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA，其中B1-3和B1-1的诱导率较高，分别为81.4%和80.1%。萘乙酸（NAA）与玉米素（ZT）组合诱导4个不同色素万寿菊的愈伤组织不定芽分化率普遍高于NAA与6-BA组合，其中B1-3葉片和茎段的愈伤组织在MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT中的不定芽分化效果较佳，分化率分别达72.5%和57.7%。适宜色素万寿菊不定芽生根的培养基为1/2MS+0.5 mg/L NAA，其中B1-3和Bnm的生根率均达100.0%;再生植株移栽成活率达95.0%。【结论】叶片是诱导色素万寿菊雄性不育系植株再生的良好材料，B1-3是获得色素万寿菊离体培养雄性不育植株最佳的母本资源;建立的色素万寿菊雄性不育系离体快繁体系可为其育种研究和杂交种种子生产提供资源保障。

关键词： 色素万寿菊;离体快繁体系;母本资源;植物生长调节剂;植株再生

中图分类号： S682.1                                  文献标志码： A       文章编号：2095-1191（2019）09-2029-07

Abstract：【Objiective】Establishing in vitro rapid propagation system of male sterile lines of Tagetes erecta L. to provide foundation for breeding research and hybrid seed production. 【Method】The leaves and stem segments from four mother resources male sterile plants（B1-1、B1-3、B1-4 and Bnm） of T. erecta were used as explants，and the callus induction，adventitious bud differentiation and rooting culture were conducted with different combinations of growth regulators to establish a sui table technical system for in vitro rapid propagation of T. erecta. 【Result】The regeneration ability of T. erecta with leaf as explants was stronger than that of stem segment，the rate of callus induction and adventitious bud differentiation were ranked B1-3>B1-1>Bnm>B1-4. The suitable medium for callus induction of leaves for B1-3 and B1-1 was MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-benzylaminoadenine（6-BA），and the rates of callus induction were 99.2% and 95.3% respectively. The suitable medium for callus induction of stem segments was MS+2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA，among them，B1-3 and B1-1 had higher induction rates，which were 81.4% and 80.1% respectively.The combination of nafusaku（NAA） and zeatin（ZT） for inducing adventitious bud differentiation rate was generally higher than that of the combination of NAA and 6-BA in four different T. erecta. Among them，rate of adventitious bud differentiation of leaves and stem segments of B1-3 was better in MS+1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT，which were 72.5% and 57.7%，respectively. 1/2MS+0.5 mg/L NAA was suitable for rooting. The rooting rates of B1-3 and Bnm reached 100.0%. The survival rate of regeneration plants was up to 95.0%. 【Conclusion】The leaves are fit for inducing regeneration plant of T. erecta male sterile line. B1-3 is the best female resource to obtain male sterile plants for in vitro culture. Establishment of in vitro rapid propagation system of T. erecta can provide foundation resources for its breeding and hybrid seed production.

Key words： Tagetes erecta L.; in vitro rapid propagation system; female resources; plant growth regulator; plant regeneration

0 引言

【研究意义】色素万寿菊（Tagets erecta L.）为菊科万寿菊属草本植物，其花瓣是提取叶黄素的最佳植物性原料。从万寿菊属植物中提取的叶黄素最早主要作为着色剂应用于饲料中以提高禽蛋的色泽和营养品质，之后作为抗氧化剂在医药、食品、保健品及化妆品领域应用（Dwyer et al.，2001;Granado et al.，2003），市场需求量逐年加大。万寿菊杂交育种常利用雄性不育两用系不育系作母本，与强优势的恢复系作父本配制杂交种（田海燕，2007），但在不育性的保持中，需利用两用系姊妹交保持不育性，較难获得不育株。因此，通过离体繁殖保存万寿菊雄性不育材料，对有效开展万寿菊雄性不育理论研究及拓宽其杂交制种原材料供给途径具有重要意义。【前人研究进展】国内外学者对万寿菊离体繁殖进行了许多研究。Bespalhok和Hattori（1998）以万寿菊子叶为外植体得到胚性愈伤组织并形成体胚，但最终未获得再生植株。苏福才等（1999）、田广红（2001）以万寿菊腋芽或带腋芽茎段为外植体，建立了万寿菊离体扩繁体系。Vanegas等（2002）以万寿菊茎段、胚轴和叶片为外植体进行离体培养，发现叶片的离体培养效果最佳。Kumar等（2004）、伍亚平和唐道诚（2013）建立了万寿菊雄性不育系植株的再生体系。林淦和周建平（2006）、赵子刚等（2010）以万寿菊叶片为外植体进行离体培养获得了再生植株。李甫等（2007）以万寿菊花药为外植体，获得了单倍体再生植株。孙婵娟（2009）、曾水玉（2012）以万寿菊茎段为外植体，探讨其试管苗开花途径。石虹梅和俞明月（2017）对比以菊花带芽茎段、节间中段及叶片为外植体的组织培养效果，发现节间中段的脱分化、再分化过程明显且成功率高。【本研究切入点】色素万寿菊离体培养过程中褐化、玻璃化及污染严重仍是难以解决的问题，由于其雄性不育植株取材时间具有特殊性，因此其离体快繁难度较大，如在万寿菊育种实践中只有待植株现蕾后才能区分雄性不育母本资源的可育植株和不育植株，但目前关于通过离体快繁收集并保存不同基因型色素万寿菊不育植株、扩繁母本资源、建立遗传稳定性一致优良繁育体系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以4个不同基因型色素万寿菊母本资源现蕾5～10 d不育植株相对幼嫩的叶片和茎段为外植体，采用正交试验，分析2，4-D与6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）组合对其愈伤组织诱导、萘乙酸（NAA）与6-BA和NAA与玉米素（ZT）组合对不定芽分化及NAA对生根的影响，旨在建立色素万寿菊雄性不育系离体快繁体系，短期内繁殖并保存大量遗传稳定一致的雄性不育母本资源，为开展色素万寿菊育种研究和杂交制种提供资源保障。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试色素万寿菊杂交母本资源B1-1、B1-3、B1-4和Bnm（均由内蒙古赤峰市喀喇沁旗科学技术协会张永强老师提供，其他信息见表1）雄性不育株的幼嫩叶片和茎段采自云南省曲靖博浩生物科技股份有限公司大棚现蕾1～5 d的色素万寿菊植株。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体表面消毒 将采集的叶片和茎段经流水冲洗30 min后，用75%酒精浸泡30 s，再用1.0 g/L HgCl2消毒10 min，无菌水冲洗4～6次后，无菌滤纸吸干外植体表面水分。接种时剪掉叶片的叶尖和基部，切成0.5 cm×0.5 cm小块;茎段切成长0.5～1.0 cm小段。1%柠檬酸无菌液浸泡数秒后接种于诱导培养基。

1. 2. 2 愈伤组织诱导及增殖 采用正交试验设计筛选愈伤组织诱导培养基，设2因子4水平共16个处理（处理 I1～I16）（表2）。每处理接种6瓶，每瓶接种万寿菊材料3～5个，重复3次。培养30 d后统计愈伤组织诱导率。增殖培养基为MS+0.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+2.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂，pH 5.8，每20～25 d增殖培养1次，共培养2次。培养条件：愈伤组织诱导先暗培养10 d，然后以10.0 mmol/（m2·s）光照进行光培养，增殖培养时以光照强度15.0 mmol/（m2·s）进行培养，14 h/d;温度（25±1）℃。

愈伤组织诱导率（%）=诱导愈伤组织数/接种外植体数×100

1. 2. 3 不定芽分化 增殖良好的愈伤组织接种于不定芽分化培养基中进行不定芽分化。以MS为基本培养基，添加不同浓度（0.5和1.0 mg/L）NAA、（0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L）6-BA、（0.5、1.0、2.0和3.0 mg/L）ZT、30.0 g/L蔗糖和7.0 g/L琼脂（具体组合见表2和表3），pH 5.8。每个组合接种6瓶，每瓶接种愈伤组织3～4块，重复3次，培养25～30 d后统计不定芽分化率。培养条件：光照20.0 mmol/（m2·s），14 h/d;温度（25±1）℃。

不定芽分化率（%）=分化出芽的愈伤组织数/接种愈伤组织数×100

1. 2. 4 生根培养 分化得到的不定芽转入1/2MS和MS培养基中进行生根培养，分别添加0～0.5 mg/L NAA+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L琼脂+2.0 g/L活性炭，pH 5.8。生根培养条件：光照30.0 mmol/（m2·s），14 h/d，温度（25±1）℃。待根长达5.0 cm 时，将生根植株炼苗5 d，移栽至装有腐殖土的花盆中，移栽后10 d内，用80%遮阳网遮光避免阳光直晒，之后每天增加直晒时间，每一母本资源移栽50株，30 d后统计成活率。

生根率（%）=生根苗数/接种苗数×100

移栽成活率（%）=移栽成活的植株数/移栽的总株数×100

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行统计，以SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2. 1 色素万寿菊外植体愈伤组织诱导情况

不同基因型色素万寿菊母本资源的外植体接种于愈伤组织诱导培养基5～7 d，各处理的叶片开始皱缩、卷曲，边缘出现白色或淡黄绿色愈伤组织（图1-A），10～20 d为愈伤组织快速变大期（图1-B），25 d后愈伤组织几乎停滞生长，需及时对愈伤组织进行转接，以防其褐化;以茎段为外植体诱导产生的愈伤组织比以叶片为外植体诱导的稍滞后，愈伤组织先从两端切口长出（图1-C），愈伤组织的质地也以茎段诱导的比以叶片诱导的紧实，在较高的2，4-D浓度下茎段上有根长出（图1-D）。说明不同外植体启动脱分化时间、形成愈伤组织的质地和形态存在差异。

2. 2 不同生长调节剂对色素万寿菊愈伤组织诱导的影响

由表2可知，以同一母本资源色素万寿菊的叶片和茎段为外植体，叶片的愈伤组织诱导率均明显高于茎段;B1-3、B1-1和Bnm叶片的愈伤组织诱导率均在80.0%以上，而B1-4叶片的愈伤组织诱导率总体上均较低;4个母本资源叶片的愈伤组织诱导率总体上表现为B1-3>B1-1>Bnm>B1-4，其中B1-3和B1-1以I13处理（即2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA）的愈伤组织诱导效果最佳，分别为99.2%（B1-3叶片I16处理的愈伤组织诱导率也为99.2%，但诱导的愈伤褐化率较I13处理高，愈伤的诱导质量比I13处理差）和95.3%;以茎段为外植体进行愈伤组织诱导时，4个色素万寿菊母本资源的愈伤组织诱导效果均以I16处理（即2.0 mg/L 2，4-D+2.0 mg/L 6-BA）最佳，其中又以B1-1和B1-3的诱导率较高，分别为80.1%和81.4%（B1-3茎段I15处理的愈伤组织诱导率也是81.4%，但其很多愈伤仅在茎段两端出现，诱导质量比I16处理差）。说明不同基因型及不同生长调节剂组合对万寿菊母本资源愈伤组织的诱导效果存在明显差异。愈伤组织转至增殖培养基后，10～20 d为愈伤组织旺盛生长期，经2次继代增殖后，愈伤组织表面呈颗粒状，浅绿色或浅黄绿色，部分愈伤组织上夹杂绿色芽点（图1-E和图1-F）。

2. 3 NAA与6-BA组合对色素万寿菊愈伤组织不定芽分化的影响

由表3可知，以同一母本资源色素万寿菊的叶片和茎段为外植体，在NAA和6-BA组合处理下，叶片的愈伤组织不定芽分化率明显高于茎段;4个母本资源叶片愈伤组织不定芽分化率排序总体上表现为B1-3>B1-1>Bnm>B1-4;当NAA浓度为0.5 mg/L时，4个母本资源叶片和茎段的愈伤组织不定芽分化率随6-BA浓度的增加呈上升趋势;在8个NAA和6-BA组合处理中，B1-3、B1-4和Bnm叶片和茎段愈伤组织的不定芽分化率均以D8组合最高，其中叶片的愈伤组织不定芽分化率分别为61.9%、51.9%和62.1%，茎段的愈伤组织不定芽分化率分别为52.6%、47.2%和47.4%，即在NAA和6-BA组合处理下，B1-3、Bnm和B1-4叶片和茎段愈伤组织不定芽分化的最佳培养基均为1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA;而B1-1的叶片愈伤组织不定芽分化率以D7组合最高，为58.2%，茎段愈伤组织不定芽分化率以D8组合最高，为51.6%，即在NAA和6-BA组合处理下，B1-1叶片愈伤组织不定芽分化的最佳培养基为1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，茎段愈伤组织不定芽分化的最佳培养基为1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L 6-BA。说明不同基因型和不同生长调节剂组合对色素万寿菊叶片和茎段的不定芽分化具有明显影响。

2. 4 NAA与ZT组合对色素万寿菊愈伤组织不定芽分化的影响

由表4可知，以同一母本资源色素万寿菊的叶片和茎段为外植体，在NAA和ZT组合处理下，叶片的愈伤组织不定芽分化率明显高于茎段;在相同NAA浓度处理下，其不定芽的分化率总体上随ZT浓度的增加而升高;在8个NAA和ZT组合处理中，4个母本资源叶片和茎段的愈伤组织不定芽分化率均以T8组合最高，尤其以B1-3叶片和茎段的愈伤组织不定芽分化效果更突出，分化率分别达72.5%和57.7%;4个母本资源叶片和茎段的愈伤组织不定芽分化能力表现为B1-3>B1-1>Bnm>B1-4，即在NAA和ZT组合处理下，B1-1、B1-3、B1-4和Bnm叶片和茎段愈伤组织不定芽分化的最佳培养基均为1.0 mg/L NAA+3.0 mg/L ZT。

从表2和表3还可看出，NAA与ZT组合处理4个色素万寿菊母本资源的愈伤组织不定芽分化率均普遍高于NAA与6-BA组合。说明ZT与NAA组合对色素万寿菊愈伤组织不定芽分化的促进作用大于NAA与6-BA组合。

2. 5 不定芽的生根培养

将4个色素万寿菊的不定芽分别接种至1/2MS和MS培养基中，5～10 d后在芽的基部均能长出细根，其生根率见表5。观察发现，在不添加任何激素的培养基中，色素万寿菊根系生长相对缓慢，分支少，而在添加NAA的培养基中，色素万寿菊发根较快，平均约5 d即长出根，且根相对粗壮，分支多。1/2MS培养基较MS培养基有利于色素万寿菊生根培养，其中在1/2MS+0.1～0.5 mg/L NAA培养基中，B1-3和Bnm的生根效果较佳（图1-G），生根率均为100.00%，B1-4的生根效果稍差，生根率分别为86.50%和90.10%（表5）。将生根后的色素万寿菊完整植株经炼苗移栽至花盆中，遮阴、保湿培养30 d后幼苗移栽成活率在95.00%以上，经2～3个月的发育生长，获得的再生植株全部為雄性不育材料（图1-H）。

3 討论

植物组织培养中，植物基因型、外植体生理状况、培养基、生长调节剂种类和组合及培养条件等均会影响培养效果。在万寿菊组织培养研究中，多数研究者以幼嫩的营养器官如腋芽、含腋芽的茎段、叶片及无菌苗获得的子叶和下胚轴为外植体，很少使用成熟植株的器官（付洪伟等，1999;孙婵娟，2009;赵子刚等，2010;Pratibha and Datta，2001），而作为杂交母本的万寿菊雄性不育系，只有等到现蕾后通过花序形态才能区分不育株与可育株，使其组培研究具有一定难度，但可通过不育株离体快繁有效保存母本资源（张华丽等，2011）。本研究中，采集色素万寿菊现蕾后能分辨可育株与不育株的相对幼嫩叶片和茎段为外植体，比较两种外植体的愈伤组织诱导、不定芽分化和生根效果，得出叶片对愈伤组织诱导速度及诱导率、不定芽分化率高于茎段的结论，与Vanegas等（2002）、齐迎春等（2005）、郑杰等（2012）的研究结果一致。本研究中采用的色素万寿菊叶片需经愈伤组织诱导途径才能进一步分化不定芽，与林淦和周建平（2006）、赵子刚等（2010）利用万寿菊叶片可直接产生不定芽的研究结果不一致，可能与所利用万寿菊基因型存在差异、材料生理状态不同和生长调剂组合不同有关。

生长调节剂是影响万寿菊离体培养的关键因素，多数学者在万寿菊的研究中采用6-BA与NAA组合（齐迎春等，2005;林淦和周建平，2006）或6-BA与IAA组合（Vanegas et al.，2002;赵子刚等，2010;张华丽等，2011）诱导不定芽获得再生植株，本研究使用6-BA与NAA和ZT与NAA组合进行色素万寿菊雄性不育株离体培养效果较佳，与付洪伟等（1999）对杂种大花万寿菊侧芽的研究结果相似。本研究结果表明，1/2MS+0.5 mg/L NAA有利于色素万寿菊不定芽根系生长，与刘军等（2004）的研究结果相似。

4 结论

叶片是诱导色素万寿菊雄性不育系植株再生的良好材料，B1-3是获得色素万寿菊离体培养雄性不育植株最佳的母本资源;建立的色素万寿菊雄性不育系离体快繁体系可为其育种研究和杂交种种子生产提供资源保障。

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（責任编辑 思利华）