NALP6信号转导通路在痛风性关节炎发病过程中的作用机制

隋方宇　姜德友　韩洁茹　周雪明　赵铭宇　解颖

摘要 目的：探讨NALP6信号转导通路在痛风性关节炎（GA）发病过程中的作用机制。方法：选取慢病毒转染技术干扰NALP6蛋白的基因表达，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blotting）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等技术检测细胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表达情况;结果：干扰成纤维滑膜细胞中NALP6基因的表达，能减低痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞中NALP6蛋白的表达、降低caspase-1和核因子-κB的活性，降低IL-1β含量;结论：NALP6炎性反应信号转导通路参与了大鼠痛风性关节炎的发病过程，通过能够干扰NALP6基因表达的慢病毒转染技术能保护痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞的炎性损伤。

关键词 痛风性关节炎;NALP6信号转导通路;caspase-1;白细胞介素-1β;核因子-κB;慢病毒转染;成纤维样滑膜细胞;靶点

Study on the Mechanism of NALP6 Signal Transduction Pathway in the Pathogenesis of Gout Arthritis

Sui Fangyu1，Jiang Deyou1，Han Jieru1，Zhou Xueming1，Zhao Mingyu2，Xie Ying1

（1 Basic Medicine Collage，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2 Department of Gynecology，Heilongjiang Hospital of TCM，Harbin 150036，China）

Abstract Objective：To investigate the action mechanism of the NALP6 signal transduction pathway involved in gout arthritis（GA）.Methods：The lentiviral transfection technology was used to interfere the expression of NALP6 gene and the expression of NALP6，caspase-1，IL-1β and NF-κB was detected by using Elisa，Western Blot and RT-PCR technology.Results：Interfering the expression of the NALP6 genes could reduce the expression levels of NALP6 protein and RNA and NF-κB protein，the activity of caspase-1 and the content of IL-1β in fibroblast-like synoviocytes.Conclusion：1）The study confirmed that the NALP6 signal transduction pathway is involved in the pathogenesis process of GA in rats and revealed that the inflammatory signal of “NALP6-caspase-1-IL-1β” and the cycle pathway of inflammatory cascade between IL-1β and NF-κB play an important role in the process of gouty arthritis.2）The method of interfering the genes expression of NALP6 by lentiviral transfection technology can protect the inflammation injury of fibroblast-like synoviocytes.3）Regarding NALP6 as a target may provide a new idea for clinical prevention and treatment of gouty arthritis.

Key Words Gouty arthritis; NALP6; caspase-1; IL-1β; NF-κB; Lentiviral transfection; Fibroblast-like synoviocytes; Target

中圖分类号：R229;R593文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.09.011

NALP6炎性反应体可以诱导caspase-1的活化并且能够参与核因子-κB的调控，进而参与炎性反应的过程。但是，NALP6是否在痛风性关节炎（GA）发病机制中起一定的作用，尚未见报道。因此，我们采用大鼠成纤维样滑膜细胞制成GA模型，运用慢病毒转染技术干扰NALP6基因的表达，通过观察NALP6、caspase-1、白细胞介素（IL）-1β和核因子-κB的表达情况，探讨NALP6炎性信号通路在GA发病过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

选取10周龄健康雄性SD大鼠成纤维样滑膜细胞（万类生物科技公司提供）。

1.1.2 仪器

慢病毒转染使用仪器和试验。见表1，2。NALP6信号转导通路在痛风性关节炎发病过程中的作用机制研究仪器和试验。见表3，4。

1.1.3 试剂

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1）慢病毒转染分组：选取空白组、空转染慢病毒载体对照组、NALP6干扰表达慢病毒载体组。

2）NALP6信号转导通路在痛风性关节炎发病过程中的作用机制研究分组：每3孔为一组，共分为4组：a.空白组：正常滑膜细胞;b.模型组：滑膜细胞+尿酸钠;c.模型空转染组：滑膜细胞+尿酸钠+空转染慢病毒载体;d.模型NALP6转染组：滑膜细胞+尿酸钠+NALP6干扰慢病毒载体。

模型制备：将大鼠成纤维样滑膜细胞进行原代培养并留取第三代细胞用于后续实验，加入MSU溶液制备成痛风性关节炎模型。

1.2.2 检测指标与方法

1）慢病毒转染：通过ddCt RQ（Relative Quantitation）以扩增公式2-△△Ct对NALP6的表达量进行分析计算。

2）NALP6信号转导通路在痛风性关节炎发病过程中的作用机制研究：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western blotting）、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等技术检测细胞中NALP6蛋白、caspase-1、IL-1β、核因子-κB的表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。如果数据资料满足正态性和方差齐性，则应用单因素方差分析;如不满足上述条件则采用非参数检验方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组慢病毒转染比较

与空白组比较，空转染慢病毒载体空白组NALP6表达无明显变化，NALP6干扰表达慢病毒载体组的NALP6表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.2 NALP6信号转导通路在痛风性关节炎发病过程中的作用机制

2.2.1 各组滑膜细胞中IL-1β含量的变化

与空白組比较，模型组细胞中IL-1β含量明显升高;与模型组比较，模型NALP6转染组细胞内IL-1β含量下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表6。

2.2.2 各组滑膜细胞中caspase-1活性

与空白组比较，模型组细胞中caspase-1活性明显升高;与模型组比较，模型NALP6转染组细胞内caspase-1活性下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表7。

2.2.3 各组滑膜细胞中NALP6蛋白表达比较

与模型组比较，模型NALP6转染组细胞内NALP6蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），经慢病毒转染干扰NALP6基因表达能够降低痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞中NALP6蛋白的表达。见图1。

2.2.4 各组滑膜细胞中核因子-κB蛋白表达比较

与空白组比较，模型组细胞中核因子-κB蛋白表达明显升高;与模型组比较，模型NALP6转染组细胞内核因子-κB蛋白表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），经慢病毒转染干扰NALP6基因表达能够降低痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞中核因子-κB蛋白的表达。见图2。

2.2.5 各组滑膜细胞中IκB蛋白表达比较

与空白组比较，模型组细胞中IκB蛋白表达明显降低;与模型组比较，模型NALP6转染组细胞内IκB蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），经慢病毒转染干扰NALP6基因表达能够升高痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞中IκB蛋白的表达。见图3。

2.2.6 各组滑膜细胞中NALP6mRNA表达情况

与空白组比较，模型组细胞中NALP6mRNA表达明显升高（P<0.05）;与模型对照组比较，模型NALP6转染组细胞内NALP6mRNA表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），经慢病毒感染干扰NALP6基因能够降低痛风性关节炎成纤维样滑膜细胞中NALP6mRNA的表达。见表8。

3 讨论

GA是一种自身炎性疾病[1]，其发病机制非常复杂，细胞外的尿酸浓度过饱和形成微晶尿酸钠（MSU）晶体，刺激一系列细胞因子、趋化因子的释放，进而引起了关节的疼痛、肿胀、痛风石形成等炎性反应[2]。因而MSU晶体是痛风发病机制中的启动因素。虽然MSU晶体在痛风的发病机制中其作用已经阐明，但在滑膜细胞内MSU作为一个危险信号如何与免疫系统相互作用有待进一步研究。本实验属于导师国家自然科学基金项目课题中的一部分研究[3-7]，本课题组前期在miR芯片筛选实验已经证实了NALP6参与了GA的发病过程，但其机制尚不明确，这也是本实验研究的重点内容。

痛风性关节炎发病机制以IL-1β级联的炎性反应为特征[8]。大鼠滑膜细胞慢病毒转染实验显示，MSU刺激的GA滑膜细胞内NALP6表达上调，炎性反应递质caspase-1活性，IL-1β含量以及核因子-κB表达均显著增高，与NALP6表达正相关，提示NALP6参与了痛风性关节炎的发生。通过转染沉默NALP6蛋白表达的慢病毒感染过程，能明显降低caspase-1活性、IL-1β含量以及核因子-κB表达，提示NALP6可以正调控炎性反应递质caspase-1、IL-1β等。因此推测NALP6对caspase-1及核因子-κB有正调控作用。

痛风性关节炎的大鼠体外研究表明，尿酸钠盐被滑膜表面或胞内的模式识别受体（Pattern Recognition Receptor，PRR）识别，诱导NAPL6形成炎性复合体[9-10]，从而活化caspase-1，剪切pro-IL-1β，产生成熟的IL-1β，IL-1β活化IL-1R[11-15]，激活核因子-κB。上述一系列反应释放大量细胞因子、趋化因子等引发痛风性关节炎的炎性反应。组织表现为局部充血、水肿、大量炎性反应细胞浸润、纤维素渗出，同时沉积部位出现组织凝固性坏死，结缔组织细胞间质纤维变性。我们借助慢病毒转染技术证实，沉默NALP6表达能降低NALP6炎性反应体激活的能力，影响caspase-1的生成，降低某些炎性反应递质（IL-1β和IL-18）产生，从而抑制痛风性关节炎的发生。

综上所述，NALP6蛋白信号转导通路在GA中起重要作用，对NALP6的表达进行抑制，可明显抑制caspase-1的活性和IL-1β的含量，可为临床防治GA提供新靶点。

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（2018-07-04收稿 责任编辑：杨觉雄）