基于近红外光谱法对防风中色原酮含量快速测定的研究

卢泳，孙冬梅，王洛临，李智勇，李树民，李洁环，冯健英，陈雪婷，徐文杰

(1.广州中医药大学第五临床医学院，广东 广州 510095； 2.广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

防风为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根[1]，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效[2]。防风的成分主要包括色原酮类、香豆素类、有机酸、多糖类、聚炔类、甾醇类等[3]，其中色原酮作为防风的主要活性成分之一，具有解热、镇痛、抗感染的作用[4]。2015年版《中国药典》一部[防风]项下收载了防风中2种色原酮的质量分数测定方法，该方法样品处理和测定均耗时较长，因此建立一种快速、准确、简便的防风色原酮质量分数测定分析方法具有重要意义。近年来，近红外光谱(near infrared spectrum,NIRS)分析技术由于具有样品一般无需预处理、测量快速无损、操作简便、绿色环保等优点，广泛用于制药、食品、石油、农业等领域。本研究以防风药材为研究对象，用声光可调滤光器(AOTF)便携式近红外仪采集其近红外光谱，建立其2种色原酮(升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷)的定量分析模型，为防风药材中色原酮质量分数的快速检验提供一种新方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HH-8恒温水浴锅(邦西仪器科技上海有限公司)；METTLER TOLEDO XS205 DualRange型电子分析天平(德国梅特勒-托利多有限公司)；YR-150多功能粉碎机(永康市五瑞工贸有限公司)；Agilent Technologies 1200 series型高效液相色谱仪(G1322A脱气机，G1312A二元梯度泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B VWD检测器)；AOTF Luminary 3060型声光可调滤光器近红外光谱仪，配有积分球漫反射附件、铟镓砷(InGaAs)检测器、CaF2分束器、样品旋转器、石英样品杯(美国Brimrose公司)。

1.2 试药

93批防风药材分别购自外蒙古、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、甘肃、山西、河南、河北、湖南、湖北等产地，经广东省中医药工程技术研究院李智勇博士鉴定均为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk的干燥根。

升麻素苷对照品(批号：111522-201511)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品(批号：111523-201509)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇(赛默飞世尔中国有限公司，色谱纯)、水(广州屈臣氏食品饮料公司)、甲醇(广州化学试剂厂，分析纯)。

2 方法与结果

2.1 HPLC法测定防风中2种色原酮的质量分数[5]

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-水(40∶60)，流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；理论塔板数按升麻素苷峰计算应不低于2 000。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取升麻素苷对照品和5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，加入甲醇，制成每1 mL含升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷分别为127.2、128.0 μg的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取防风药材细粉约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，水浴回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，取续滤液，即得。

2.1.4 样品测定 精密称取样品0.25 g，按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液2 μL，注入色谱仪，按“2.1.1”项下条件测定升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量分数。93份样品中升麻素苷的质量分数范围为0.066 4%～0.656 0%；5-O-甲基维斯阿米醇苷质量分数范围为0.117 5%～0.749 7%。

2.2 近红外光谱定量模型的优化和建立

2.2.1 近红外光谱的采集 将收集到的93批防风样品粉碎后过80目筛，取约8 g药粉放入石英样品杯中，平铺均匀，以空气为参比，采用积分漫反射部件进行扫描，仪器参数：波长范围1 100～2 300 nm；光程2 nm；扫面次数100次；温度25 ℃；相对湿度40%。每批样品重复装填并扫面3次，求平均图谱。93批样品近红外图谱叠加图见图1。

0.80.70.60.50.40.31100130015001700190021002300λ/nmAbsorbance

图193批防风药材近红外光谱叠加图

Figure1NIR spectrum overlay of 93 batches Radix Sanoshnikovia

由图1可知，1 100～2 300 nm波段区间内光谱比较平滑，不同样品间的近红外光谱吸收无明显差异，但1 300～2 200 nm区间近红外光谱信息量较丰富，能反映出样品中的色原酮质量分数差异，因此在此区间内进行建模研究。

2.2.2 近红外光谱定量模型的建立

2.2.2.1 模型评价指标的确定

本研究采用校正相关系数(Rc)、预测相关系数(Rp)、校正标准偏差(RMSEC)、预测标准偏差(RMSEP)作为指标筛选，其中Rc和Rp越接近1，表示预测值与测定值越接近[6]。RMSEC和RMSEP越小，两者差异越小，说明模型的预测效果越好，适用性就越好。

2.2.2.2 样本集的划分

根据样品中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷质量分数测定结果，利用随机(random selection，RS)法[7]选取83个具有代表性的样品组成校正集，其余10个样品为验证集，二者比例为8∶1，各样品的质量分数范围见表1。验证集样品的质量分数范围在校正集样品质量分数范围内，可用于近红外光谱定量模型的建立。

2.2.2.3 建模方法的选择

在近红外光谱分析中常用的多元定量校正方法，是建立分析仪器响应值与物质质量浓度之间定量数学关系的一类算法。在近红外光谱仪分析中常用的定量建模方法包括多元线性回归(MLR)法、主成分回归(PCR)法和偏最小二乘(PLS)法等线性校正方法。其中，PLS在近红外光谱分析中得到较为广泛的运用，成为了一种常用的建模方法。因此，本研究选择PLS建模，以期得到较为稳定、预测能力较好的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的定量模型。

2.2.2.4 不同光谱预处理方法的选择

药材样品由于颗粒大小和光散射等噪声信息及测定条件等差异，导致基线漂移影响近红外光谱定量模型的可靠性和准确性，需对原始光谱进行适当的预处理，以减少各种干扰的影响，提高分析准确度。用化学计量学软件对原始光谱进行预处理，其常见的光谱预处理方法有多元散射校正(MSC)、标准正态变量变换(SNV)、求导(一阶导数1st Derivative、二阶导数2nd Derivative)、平滑处理(S-G卷曲平滑、Norris平滑)[8-10]等。以模型评价指标Rc、Rp、RMSEC、RMSEP，通过对预处理方法的对比优选出S-G卷曲平滑作为升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷定量模型光谱预处理方法。结果见表2。

2.2.2.5 不同光谱区段的选择

由于全波段光谱中除包含待测组分信息，还包含大量冗余信息，为获取与待测组分质量分数相关的最大信息、减少冗余信息，以建立最优的预测模型[11]，对不同光谱范围所建模型性能进行考察，结果见表3。通过与其他波段的对比，确定1 300～1 900 nm为升麻素苷定量模型最佳建模区间、优选出1 300～2 200 nm为5-O-甲基维斯阿米醇苷定量模型最佳建模区间。

2.2.2.6 主成分的选择

主成分对模型的建立具有很大的影响，过少或过多均会影响模型的准确性[12]。本研究以RMSEC为指标，RMSEC越小，预测准确度越高。以影响模型的主成分值为横坐标，RMSEC为纵坐标作图，得图2。结果表明升麻素苷定量模型的最佳主成分值为16，此时RMSEC为0.028；5-O-甲基维斯阿米醇苷定量模型的最佳主成分值为19，此时RMSEC为0.011 9。

2.2.2.7 定量模型的建立

分别将83批升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷校正集样品，通过The Unscramler7.8化学计量学软件结合PLS法，按表4所示升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的最优建模参数，建立定量分析模型。结果见图3。

表1 升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷定量模型校正集和验证集的划分Table 1 Partition of calibration and validation set in prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methyl-vismitol

表2 不同光谱预处理方法对NIR模型的影响Table 2 Influence of different pretreatment on NIR model

表3 不同波长范围对NIR模型的影响Table 3 Influence of different wavelength range on NIR models

由图3可知升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷Rc分别为0.975 8、0.992 3，Rp分别为0.904 0、0.907 3；RMSEC分别为0.028、0.011 9；RMSEP为0.055 6、0.041 3。说明模型可以用于色原酮成分的定量分析，且预测误差较小，NIRS预测值与HPLC实测值差异无统计学意义，模型准确度和预测结果良好。可以采用近红外光谱法对升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的质量分数进行快速无损的测定。

2.2.2.8 定量模型的验证

分别在建立的定量分析模型中，将升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷验证集样品质量分数的测定值与预测值进行比较并计算平均相对误差，详见表5。结果表明，NIRS所建模型的对升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷质量分数的预测结果与HPLC法的测定结果接近，平均相对误差均小于10%，表明所建模型具有良好的预测能力，可用于防风药材中2种色原酮质量分数的测定。

3 讨论

本研究采用NIRS法建立了防风药材中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷2种色原酮成分的快速检测方法，建立的定量模型预测精度较高，预测集的平均相对误差均<10%。相较传统的HPLC方法，不需要繁琐的供试品制备，不消耗化学试剂，不产生任何污染[13]。

近红外光谱技术作为一种分析速度快、效率高的在线分析技术，一般检测限为0.1%，不适用于痕量分析[14]。虽然在本研究中部分样本集升麻素苷的质量分数低于0.1%，但运用这些样本所建立的定量模型相关系数仍都大于0.9，模型预测准确度、精密度较好。说明近红外光谱技术对于某些质量分数低于0.1%的化学成分同样适用。

0.120.110.100.090.080.070.060.05RMSEC135791113151719主成分值135791113151719主成分值0.100.090.080.070.060.050.04BA

A.升麻素苷； B. 5-O-甲基维斯阿米醇苷。

AB0.10.20.30.40.50.60.70.80.10.20.30.40.50.60.70.80.70.60.50.40.30.20.100.80.70.60.50.40.30.20.10实测值/%预测值/%实测值/%

A.升麻素苷； B.5-O-甲基维斯阿米醇苷。

图3防风中2种色原酮成分的定量校正模型
Figure3Quantitative calibration models of two chromones in Radix Saposhnikoviae

表5 验证集样品中2种色原酮成分质量分数的HPLC与NIRS测定结果

Table5HPLC measured and NIRS predicted mass fraction results of two chromones in validation setw/%

编号升麻素苷HPLC法NIRS法平均相对误差编号5-O-甲基维斯阿米醇苷HPLC法NIRS法平均相对误差FF040.331 20.355 06.138 2FF140.213 30.185 18.509 3FF100.334 30.356 0FF190.201 10.203 0FF140.246 80.217 7FF230.155 50.171 6FF210.118 40.134 2FF400.208 50.215 8FF280.270 90.216 0FF620.313 20.337 2FF370.248 50.296 0FF670.367 20.331 7FF410.270 50.211 0FF740.354 90.350 4FF820.259 50.207 0FF790.237 70.293 0FF880.324 60.325 0FF840.296 2 0.331 9FF910.136 10.147 0FF870.371 80.360 3

本研究共收集不同质量分数的防风药材共93批，得到的定量校正模型预测相关系数均在0.9以上；但未高于0.95，预测结果还存在一定的误差。这可能是因为防风产地分布广、含量丰富，所采用的样本集不具有较好的代表性导致的。此外，还可能是因为本研究中色原酮成分在长波近红外光谱范围的基线漂移、噪音影响较大，结构信息不够丰富而导致模型预测有一定的误差。在后期实验中应扩大样本范围，采用近红外光谱全波长进行建模，结合更多更优的化学计量学方法提高2种色原酮模型的预测能力。