纳米银运载紫杉醇抑制肺癌A549细胞生长的机制研究

邹建军，苏珊，曾云云，张贤兰，谢亚琳，苏宁，岑文昌

(广州市胸科医院，广东 广州 510095)

据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告显示，世界癌症患者和死亡病例每年都在不断增加，近一半新增癌症病例出现在亚洲，而中国占大多数，并且新增癌症病例高居全球首位[1-2]。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,目前全球原发性肺癌发病率位居癌症发病第6位，死亡率位居癌症死亡率第3位，极大地威胁着人们的生命和健康[3]。多数肺癌发现时已为晚期，不能手术切除[4]，所以化疗是一种可供选择的治疗方法，然而，肺癌对化疗药物敏感性极低，其治疗仍是临床难点[5]。紫杉醇是一种常见的化疗药物，其较低剂量即可达到抑制癌基因的效果，然而紫杉醇最大的缺点是水溶性差、副作用大及低渗透性[6-7]。因此，寻找一种适合的载体以期能解决以上问题。纳米银(AgNPs)具有高稳定性和渗透性的特点，可作为良好的药物载体[8]。因此，本研究设计将纳米银运载紫杉醇，使紫杉醇高效地进入细胞膜，并评估其抗癌效应。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

紫杉醇(PTX)、硝酸银(AgNO3)、维生素C(vitamin C)、碘化丙啶(PI)、 DAPI染色液、噻唑蓝(MTT)均购于美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购于上海碧云天公司。主要使用的仪器为纳米粒度电位仪(Zetasizer 3000HS,英国马尔文公司)及透射电镜(H-7650,日本日立公司)。

1.2 细胞培养

A549人肺癌细胞及HK-2人肾皮质近曲小管上皮细胞购于ATCC公司。细胞接种于含10%(φ)胎牛血清(Gibco，美国)和DMEM基础培养基(Gibco，美国)，于37 ℃，5%(φ)CO2培养。

1.3 功能化纳米银的制备及表征

配制400 μg/mL的维生素C溶液， 取100 μL逐滴滴加到4 mL AgNO3溶液中，搅拌1.5 h后，透析纯化得到AgNPs溶液。取上述AgNPs溶液，加入 PTX， 搅拌1 h后10 000 r/min 离心10 min，弃上清，沉淀用去离子水洗3遍，冷冻干燥后得到AgNPs运载PTX的纳米载药体系。采用纳米粒度电位仪检测AgNPs负载PTX的粒径和电位； 透射电镜用于观察AgNPs负载PTX纳米颗粒形貌变化。

1.4 AgNPs运载PTX对细胞毒性检测

A549细胞和HK-2细胞于37 ℃，5%CO2培养。分别测定不同药物组对A549及HK-2细胞的存活率。细胞存活率用MTT法进行测定。用0.25%胰酶消化细胞，以4×104个/mL和5×104个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。置37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，加入含有不同药物浓度的培养基各100 μL，继续培养12 h。加入 MTT (5 mg/mL) 20 μL/孔，37 ℃孵育5 h后吸弃培养板孔中的液体，加入 DMSO 150 μL/孔，振荡10 min，紫色结晶物充分溶解后，测定各孔A570值。以无任何处理的细胞组为对照组，其A570为100%，计算药物处理组细胞存活率。细胞存活率(%)=(A570实验组/A570对照组)×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞周期的变化

药物处理后细胞周期的变化采用流式细胞术检测。将6×104个A549细胞接种于6 cm 培养皿中，培养24 h，加入AgNPs、PTX、Ag@PTX，48 h后将细胞消化并和上清一同离心1 200 r/min,6 min,加入1 mL预冷的70%(φ)乙醇重悬， -20 ℃放置过夜固定。次日，离心收集细胞，PBS洗3次，加500 μL PI。工作液避光染色15 min。采用300目尼龙网过滤细胞悬液，用流式细胞仪检测。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡

药物处理48 h后，用PBS洗涤1次，4%(φ)多聚甲醛固定细胞30 min，用PBS洗涤1次。 加入0.3%Triton X-100的PBS，室温孵育5 min。然后样品上加50 mL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min， DAPI染色30 min。再用PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察结果。

1.7 统计学方法

所有实验重复3次，数据统计采用SPSS13.0软件分析，不同处理组之间细胞生存率的比较采用多个样本率的卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ag@PTX体系的制备和表征

如图1。A图为电镜下观察AgNPs、PTX修饰的纳米银(Ag@PTX)，可见Ag@PTX为均匀、分散的球状颗粒。B图为两种组分的粒径大小，C图是两种组分的电位分析，其中Ag@PTX为正电位，有利于进入细胞。B图和D图的大小分布图，提示Ag@PTX在30 d内能稳定于2～2.5 nm大小，此小尺寸将同样有利于颗粒进入细胞发挥作用。

2.2 Ag@PTX对A549细胞活性的抑制作用

用MTT法检测经AgNPs、 PTX及 Ag@PTX处理后的A549细胞增殖情况。图2A是各药物组处理后的细胞形貌变化，可以看出，Ag@PTX组明显抑制细胞增殖，细胞皱缩变圆，细胞数量减少。经AgNPs、PTX及Ag@PTX处理后，A549细胞存活率分别为： 83%、75%及27%。经2.5、5、10 μg/mL不同浓度Ag@PTX处理后，A549细胞组存活率分别为65%， 26%及13%，HK-2细胞存活率分别为97%、95%及94%。经统计，HK-2细胞比A549细胞生存率高，表明Ag@PTX对肺癌A549细胞有抑制作用，但对HK-2细胞抑制较弱。此外，不同药物组HK-2细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05)，表明Ag@PTX对正常细胞毒性低。

AB252015105Number/%总数Ag@PTX?104AgNPsAgNPsAg@PTX20151050-1002001000100011000D/nm3.02.52.01.51.00.50D/nm0248102030U/mVt/dCDAg@PTXAgNPs

A、B、C、D分别是AgNPs、Ag@PTX的透射电镜、电位、粒径分布及稳定性图。

图1Ag@PTX的表征
Figure1Characterization of Ag@PTX

ControlAgNPsPTXAg@PTX1209060300细胞生存率/%ConAgNPsPTXAg@PTXA549HK-2Con2.5510ABC*********ρ(Ag@PTX)/(μg?mL-1)

A.不同组分在显微镜下观察到的细胞形貌; B.不同处理组细胞存活率(其中AgNPs的浓度是2.5 μg/mL,PTX的浓度为5 μg/mL)； C.不同浓度的Ag@PTX处理后的细胞存活率。与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

图2Ag@PTX对A549细胞存活率作用
Figure2Effects of Ag@PTX on the growth of A549 cells

2.3 细胞周期阻滞与DNA片段化改变

细胞凋亡晚期，内源性核酸酶被激活，胞内DNA降解并溢出胞外，胞内总DNA降低。通过碘化丙啶染色，运用流式细胞术分析Ag@PTX 细胞凋亡及周期分布的影响。从图3A数据可以看出，经AgNPs、PTX及Ag@PTX处理后， Sub-G1期分别上升为13.1%、21.8%、27.4%，说明Ag@PTX能有效诱导A549细胞凋亡。

细胞凋亡过程发生染色质浓缩、DNA断裂，产生大量DNA片段。TUNEL能与DNA 3′末端特异性结合，产生绿色荧光，细胞核在DAPI染色后呈蓝色荧光。如图3B所示，经AgNPs、PTX及Ag@PTX处理后，Ag@PTX较其他处理组A549细胞出现更明显绿色荧光，说明DNA发生降解；细胞核在蓝色荧光DAPI染色后提示细胞核发生固缩。以上结果说明Ag@PTX能有效诱导A549细胞凋亡。

ControlAgNPsPTXAg@PTXControlAgNPsPTXAg@PTXTUNELDAPIMergeAB

A.用流式细胞术分析不同组分药物处理后，A549细胞凋亡及周期分布的影响； B.染色质浓缩和DNA断裂程度。(DAPI染色)

图3Ag@PTX诱导A549细胞凋亡
Figure3A549 cell apoptosis induced by Ag@PTX

3 讨论

纳米科技和纳米医学研究具有广阔的应用前景[9]，常用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物及示踪剂等。纳米颗粒拥有宏观物质所不具有的优良特性，如小尺寸效应、表面效应和宏观量子效应，显示出不同于常规材料等特性。国内外对AgNPs在抗菌作用方面的研究报道较多[10],AgNPs作为金属纳米材料的代表，普遍运用在医疗领域[11]。在临床泌尿外科、妇科、骨外科、皮肤科和烧烫伤外科治疗中[11]，AgNPs具有持久高效的抗环境病原菌作用，然而AgNPs作为抗肿瘤药物载体的研究报告还比较少。PTX是细胞周期非特异的细胞毒性药物[12]，有较强的广谱抗癌作用，并且在低浓度即可发挥抗癌效应。然而PTX的应用受限于其水溶性差、低渗透性和严重的副作用[13]。

本研究将AgNPs运载PTX，制备出了形貌规则、小粒径、分散均匀的Ag@PTX纳米颗粒(2～2.5 nm)，使PTX更容易、更高效地进入细胞膜。MTT实验中发现在相同PTX浓度下Ag@PTX比单独PTX更有效地抑制A549细胞增殖。而通过对正常细胞的control组和不同浓度Ag@PTX处理组间细胞活性的统计分析，发现各组间差异无统计学意义，说明AgNPs运载的PTX对正常细胞的毒性低。此外，Ag@PTX处理组细胞形态表现出较多A549细胞体积变小、皱缩、变圆及脱落，在细胞凋亡过程发生染色质浓缩、DNA断裂，产生大量DNA片段。TUNEL能与DNA 3′末端特异性结合，产生绿色荧光，细胞核在DAPI染色后呈蓝色荧光。Ag@PTX较PTX组A549细胞出现更明显绿色荧光，表明Ag@PTX有效诱导A549细胞凋亡。进一步细胞周期实验中Ag@PTX组凋亡峰也比单独的PTX组更明显。这些结果均表明Ag@PTX比单独PTX更有效抑制细胞生长，诱导A549细胞凋亡。

总之，Ag@PTX纳米颗粒能有效抑制A549细胞增殖，诱导A549细胞凋亡是其重要机制。 Ag@PTX有可能成为抗肿瘤治疗一个新的候选。