9 种常见野生食用菌总黄酮的提取鉴定分析*

2019-09-10李政东

中国食用菌 2019年8期

龙华，刘斌，李政东

(云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201)

黄酮类化合物是一种很强的抗氧化剂，能将活泼、有害的自由基还原为稳定且无害的产物，有效地清除体内的自由基。黄酮类化合物种类繁多，存在于植物体中具有抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病等多重药理作用[1]。故其作为新药研究开发的先导化合物，是一个值得重视的资源，具有重要的现实研究意义。食用菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、多糖、膳食纤维、不饱和脂肪酸、核苷、矿物元素及黄酮类、酚类等多种生理活性物质具有较高的营养价值和重要的医疗保健功能[2]。近年来，以食用菌为原料提取黄酮类化合物的研究成为近期营养学领域最重要、最具意义的研究课题之一[3]，而野生食用菌作为我国特色高营养食物，具有重要的研究价值。但目前国内外对野生食用菌黄酮类化合物的研究较少，多为人工菌、单一或少数几种菌类的黄酮提取工艺研究[4-10]。本试验采用硝酸铝-亚硝酸钠显色法分析了9种常见野生食用菌的总黄酮含量，通过显色反应对黄酮的结构种类进行初步推测，对比性较高，对分析或食用野生菌具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器试剂

选取市面常见的9种野生食用菌，分别是干巴菌（Thelephora ganbajun）、珊瑚菌（Ramaria aurea）、红汁乳菇（Lactarius hatsudake）、桃红牛肝菌（BoletusregiusKrombh）、鸡菌（Termitornyces albuminosus）、鸡油菌（Cantharellus cibarius）、正红菇（Russula vinosa）、白秃马勃（Calvatia candida）和青头菌（Russula virescens）。将整株菌子实体除去泥土等杂质，放入烘箱60℃干燥，粉碎，过200目筛，密封保存，备用。

无水乙醇、氢氧化钠、无水三氯化铁、浓硫酸、氨水、亚硝酸钠、硝酸铝，以上试剂均为分析纯。

电子天平（CP214型），购自上海奥豪斯仪器有限公司；超声波清洗机（JW-100S型），购自东莞市洁美清洗机设备有限公司；分光光度计（UV-2550型），购自岛津。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取芦丁标准品0.005 0 g，用60%乙醇溶解并定容至25 mL得芦丁标液（0.20 mg·mL-1）。

1.2.2 检测波长的确定

取1.00 mL芦丁标液于10 mL的容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；再加10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min；再加5%的NaOH溶液4.0 mL，摇匀，最后用60%乙醇定容到刻度，混匀，放置10 min，于350 nm～600 nm波长范围内扫描，确定最大吸收波长，结果见图1。

图1 芦丁的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of rutin

由图1可知芦丁在507 nm处显示最大吸收，确定后续检测波长为507 nm。

1.2.3 标准曲线的绘制

按一定梯度准确量取芦丁标准溶液0、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL、3.50 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按1.2.2项中进行操作，于507 nm处测定吸光度值。以浓度（C）为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2。得标准曲线方程为Y=0.010 8X+0.000 7，相关系数为0.999，表明线性关系良好。

图2 芦丁标准曲线Fig.2 Standard curve of rutin

1.2.4 总黄酮提取液的制备及含量测定

称取1.00 g食用菌样品于100 mL锥形瓶内，缓慢加入60%乙醇50 mL，60℃超声提取40 min，趁热抽滤，将滤液转入50 mL容量瓶，用60%乙醇定容，即为食用菌黄酮提取液。

准确移取黄酮提取液2.00 mL于10 mL容量瓶，同1.2.2项中进行操作，计算出样品中的总黄酮含量。总黄酮含量（W，mg·g-1）计算公式为：

式中：C表示由标准曲线回归方程计算所得总黄酮浓度(μg·mL-1)；V表示提取液原液体积（50 mL）；m表示样品质量（g）；n表示稀释倍数。

1.2.5 样品中黄酮类化合物的定性分析

黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基及γ-吡喃酮环有关。三氯化铁水溶液或醇溶液为常用的酚类显色剂，多数黄酮类化合物因分子中含有酚羟基故可产生阳性反应，但一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时，才呈现明显反应；黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，显酸性，可溶于碱性NaOH溶液，其中黄酮类遇碱显橙色，查尔酮、橙酮类显红色、紫红色，二氢黄酮类显深红色，黄酮醇类显黄色、棕色； 7-吡喃环上的1位氧原子因有未共用电子对，表现微弱的碱性，可与强无机酸如浓硫酸反应生成特殊颜色的盐；二氢黄酮类易在碱液中开环，转变成相应的异构体，查耳酮类化合物显橙至黄色；黄酮类化合物当分子中有邻二酚羟基取代或3, 4-二羟基取代时，在碱液中不稳定，易被氧化，产生黄色、深红色、绿棕色沉淀[11-12]。

鉴于以上原理，分别移取黄酮提取液各2 mL于4支试管中，分别加入少量3%三氯化铁、5%氢氧化钠、氨水和浓硫酸，以原提取液作为对照，观察各试管的颜色变化，作初步的定性分析。

2 结果与分析

2.1 9种野生食用菌中总黄酮的含量分析

9种野生食用菌总黄酮含量，见表1。

表1 9种野生食用菌总黄酮含量Tab.1 Total flavonoids content of 9 species of wild edible fungi

由表1可知，分析的9种野生食用菌中均含有黄酮类化合物，干巴菌的总黄酮含量最高，达6.47 mg·kg-1，红汁乳菇总黄酮含量最低，为0.62mg·kg-1，总黄酮含量从高到低依次是干巴菌、桃红牛肝菌、珊瑚菌、白秃马勃、正红菇、鸡菌、青头菌、鸡油菌、红汁乳菇。

2.2 9种野生食用菌中黄酮类化合物的定性分析

9种野生食用菌中黄酮类化合物的定性分析，见表2。

表2 野生食用菌中黄酮类化合物的定性分析Tab.2 Qualitative analysis of flavonoids in wild edible fungi

由表1可知，9种野生食用菌提取物中均含有黄酮类化合物。其中干巴菌中可能有黄酮类、黄酮醇；红汁乳菇中可能有黄酮醇；珊瑚菌中可能有黄酮类、查耳酮类和橙酮类；桃红牛肝中可能有黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇；鸡菌、鸡油菌中可能有黄酮醇和查耳酮类；正红菇中可能有黄酮类、查耳酮类和黄酮醇类；白秃马勃、青头菌中可能有黄酮类、黄酮醇类和查耳酮类。