抗菌性载银纳米微晶纤维素的制备及表征

樊丽　刘鹏涛　刘新亮

摘 要：以纳米微晶纤维素（NCC）为载体、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为分散剂，利用葡萄糖还原硝酸银以制备纳米银颗粒，得到载银纳米微晶纤维素溶液。利用紫外可见分光光度计、透射电子显微镜、X射线衍射仪对载银纳米微晶纤维素溶液进行表征。结果表明，由此体系制备的载银纳米微晶纤维素中纳米银颗粒平均粒径为10～20 nm，为晶体结构，且分散均匀。利用抑菌圈法对载银纳米微晶纤维素的抗菌性能进行检测，发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有较好的抑制作用。

关键词：纳米微晶纤维素;纳米银;抗菌性

中图分类号：TS721;TQ352

文献标识码：A

DOI：10.11981/j.issn.1000-6842.2019.02.08

细菌、霉菌等对人体有害的微生物在自然界广泛存在，人们越来越注重自身的生活、健康和安全，因此对抗菌材料的需求也日益增长。抗菌材料是一种自身具有抑菌或杀菌的功能性材料，核心成分是抗菌剂[1-3]（对细菌、霉菌等微生物具有高度敏感的化学成分）。纤维素是大自然馈赠给人类的丰富的可再生资源[4]。将纤维素分子控制在纳米级别尺寸，添加抗菌剂可合成具有抗菌性的纳米级新型材料。

王海英等[5]用硼氢化钠还原硝酸银，还原反应生成的单质银吸附在纤维素表面，制得的这种纤维素/银纳米粒子水溶胶具有良好的抗菌性。宋建恒等[6]以过氧化氢为还原剂、有机胺为分散剂、从强碱中还原硝酸银以制备超细银粉。孔茉莉等[7]以羧甲基纤维素钠为还原剂、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为分散剂，还原硝酸银以制备纳米银颗粒。相比于以硼氢化钠等为还原剂，以葡萄糖为还原剂对生物和环境没有危害，是制备纳米银粒子的“绿色”还原剂。在纳米银的制备中，纳米银晶核表面与非离子型表面活性剂PVP分子中的O原子形成键合，向四周伸展的C—H长链可以有效地防止纳米银粒子之间的团聚[8]，使生成的银原子可以均匀地吸附在纳米银晶核表面，得到呈球型的纳米银颗粒。本研究以本身具有分散性的纳米微晶纤维素（NCC）为载体[9-10]、PVP为分散剂，利用葡萄糖还原硝酸银，在纳米微晶纤维素表面原位制备纳米银颗粒，得到抗菌性载银纳米微晶纤维素材料，该材料在薄膜、凝胶等材料的抗菌及增强方面应用前景广阔[11-13]。

1 实 验

1.1 材料

纳米微晶纤维素（nanocrystalline cellulose，NCC），实验室自制[14]，长度150 nm，直径5 nm，表面电荷-1.121 mmol/g;硝酸银（AgNO3）、葡萄糖（C6H12O6）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氢氧化钠（NaOH）、浓硫酸（H2SO4）、氯化钠（NaCl）、无水乙醇，均为分析纯，天津市江天化工技术有限公司;蛋白胨、酵母粉、琼脂为生物试剂;大肠杆菌（E. coli）、金黃色葡萄球菌（S.aurieus），天津科技大学生物工程学院培养。

1.2 仪器

AL204型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;IKA RW20，天津蒙德有限公司;CAX41型电热恒温水浴锅，北京市长凤仪器有限公司;TGL-20M台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机有限公司;pH-3C型pH计，天津盛邦科学仪器技术公司;JEOL-2010透射电子显微镜，日本电子株式会社;UV-2550 PC紫外可见分光光度计，日本岛津公司;XRD-6100X射线衍射仪，日本岛津公司;BI-150A低温生化培养箱，施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 载银纳米微晶纤维素的制备

称取0.10 g的PVP，在60℃的水浴中加热，缓慢搅拌使其溶解在90.00 mL的蒸馏水中，得到PVP溶液，室温放置备用。精确称取一定量硝酸银，溶解于10.00 mL蒸馏水中，形成硝酸银水溶液，避光放置室温中备用。称取0.40 g的氢氧化钠，使其溶解在10.00 mL蒸馏水中。在水浴条件下，向50.00 mL质量分数为1%的纳米微晶纤维素溶液中加入配置好的PVP溶液，在不断搅拌的条件下，将氢氧化钠溶液逐滴加入到混合溶液中，调节pH值为8。然后再加入一定量的葡萄糖，将温度快速升至80℃，不断搅拌，并逐滴加入配置好的硝酸银溶液，继续搅拌反应一段时间，得到载银纳米微晶纤维素溶液。将所得溶液用无水乙醇和蒸馏水进行离心洗涤，并进行超声处理。

1.3.2 载银纳米微晶纤维素的表征

（1）微观形貌观测 采用JEM-2010型透射电镜观察载银纳米微晶纤维素的形态。将样品稀释后，超声分散于无水乙醇中，并用吸管将高度分散的超声液滴在超薄铜网上，加速电压为200 kV。

（2）结晶度测定 采用Bruker D8型X射线衍射仪分析载银纳米微晶纤维素的结晶形态。用Cu-Kα射线（λ=1.54 ）进行辐射，扫描范围5°～85°，扫描速度2°/min。并用Segal法计算结晶度，见式（1）：

Cr=（Iα-IβIα）×100%（1）

式中，Cr代表相对结晶度百分比;Iα代表结晶区的最大衍射强度;Iβ代表衍射角2θ=18°时的衍射强度。

（3）紫外光谱测定 采用UV-2550型紫外可见分光光度计分析载银纳米微晶纤维素在不同条件下的特征吸收峰。

1.3.3 载银纳米微晶纤维素的抗菌性测试

实验用的菌种为大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus），因此选用适合细菌生长的LB固体培养基。具体测试步骤如下：将蛋白胨10.00 g、酵母粉5.00 g、氯化钠10.00 g、琼脂15.00 g溶于1000.00 mL蒸馏水中，用煮沸的且浓度为0.10 mol/L的氢氧化钠调节溶液pH值至7.5。使用培养基前，将枪头、试管、培养皿等放入灭菌炉中在121℃下灭菌20 min后，放置无菌操作台紫外灯下冷却至50℃。将灭菌后的培养基倒置于培养皿中，在无菌操作台紫外灯的照射下至培养基充分凝固，再利用划线法把菌种放置于装有培养基的培养皿中，把直径为6 mm的圆形滤纸浸泡在不同浓度的载银纳米微晶纤维素溶液中，一定时间后取出，干燥后放入培养皿中央，将上述培养皿放置细菌培养箱中于36℃培养24 h后，观察其菌落形态，并测量抑菌圈直径，求其平均值。

2 结果与讨论

2.1 载银纳米微晶纤维素的表征

2.1.1 微观形貌分析

采用透射电子显微镜观察载银纳米微晶纤维素的形态，结果如图1所示。从图1（a）可以看出，反应体系未加入PVP时，纳米银颗粒出现团聚现象，根据能量最低原理，因为纳米银粒子具有较大的比表面积，所以容易发生团聚;从图1（b）可以看出，反应体系加入0.10 g PVP后，纳米银颗粒分散均匀，直径均匀分布在10～20 nm，无团聚现象;图1（c）是加入0.10 g PVP的载银纳米微晶纤维素的TEM图，可以看出，纳米银在纳米微晶纤维素上负载量多，且分散均匀，同时也可以看出，纳米微晶纤维素呈棒状结构，交织成网状。PVP可促进纳米银颗粒成核，防止晶粒长大，其有机长链的空间位阻作用使相互结合的纳米银颗粒表面隔开，阻止纳米银粒子团聚。

2.1.2 结晶度分析

图2所示为在80℃、以0.10 g的PVP为分散剂、2.00 g的葡萄糖为还原剂、0.17 g的硝酸银、反应时间为4 h的条件下制得的载银纳米微晶纤维素的X射线衍射（XRD）图谱。由图2可知，载银纳米微晶纤维素在2θ=38.3°、44.5°、64.5°、78.7°处有4个明显的衍射峰，这与JCPDS卡04-0783上的数据一致，分别对应面心立方晶系单质Ag（111）、Ag（200）、Ag（220）和Ag（311）晶面的衍射峰[15]。该曲线衍射峰相当尖锐，表明银的结晶性能较好。由图2还可看出，纳米微晶纤维素的特征衍射峰在2θ=16.5°、22.5°、34.7°处有3个明显的衍射峰，分别对应纤维素（101）（002）（040）晶面的衍射峰，说明纳米微晶纤维素和纳米银颗粒的相互混合并未改变各自的晶型。

2.1.3 紫外光谱分析

在80℃、以0.10 g的PVP为分散剂、2.00 g的葡萄糖为还原剂、0.17 g的硝酸银、不同反应时间条件下制得的载银纳米微晶纤维素的颜色如图3（a）所示。由图3（a）可知，随着反应时间的延长，载银纳米微晶纤维素溶液颜色从无色逐渐变为微黄色、黄棕色、红棕色、棕褐色等，说明生成了不同粒径的纳米银颗粒。利用紫外分光光度计来测定纳米银的生成过程，不同反应时间下生成纳米银的紫外吸收光谱图如图3（b）所示。从图3（b）可很清楚地看出，在300～700 nm区间出现了一个较强的特征吸收峰，其最大吸收波长位于420 nm，表明硝酸银中的银离子成功被还原为纳米银粒子。对于金属胶体而言，其吸收峰的半峰宽越宽，粒子尺寸的分布就越宽。反应时间为1 h时，纳米银的半峰宽较宽，说明此时的纳米银颗粒的粒径分布较宽，随着反应的进行，纳米银吸收峰的强度不断增强，说明生成的纳米银颗粒的浓度也在不断增加。同时可以很明显地发现，随着反应的进行，其相对应的吸收峰位置不断蓝移，从420 nm蓝移到416 nm，对应的半峰宽的宽度变窄，表明纳米银颗粒的平均粒径不断减小，并且粒径分布也不断变窄。反应4 h后，所对应的吸收峰位置和强度基本趋于稳定，表明还原反应基本结束。

葡萄糖分子中含有5个羟基和1个醛基，醛基具有还原性，在水浴加热的条件下可把银化合物溶液中的银离子还原成银单质，自身则被氧化为羧基。葡萄糖作为还原剂，其用量对纳米银粒子的粒径和形貌有显著影响。图4为在80℃、以0.10 g的PVP为分散剂、0.17 g的硝酸银、反应时间为4 h，不同葡萄糖用量条件下载银纳米微晶纤维素的紫外吸收光谱图。当葡萄糖用量较少时，生成的纳米银粒子为淡黄色，葡萄糖未能还原足够多的硝酸银，此时纳米银颗粒的特征吸收峰位置在423 nm（曲线a）处。当葡萄糖用量为3 g时，生成的纳米银颗粒的颜色为棕褐色，此时其紫外吸收峰的位置在419 nm（曲线c）处。另外，随着葡萄糖用量的逐渐增多，纳米银颗粒紫外吸收峰的强度不断增强，原子态的银聚集长大形成晶核，形成纳米银颗粒，葡萄糖用量越多，被还原的银离子越多。实验结果表明，提高葡萄糖用量，可提高纳米银颗粒的产量。

图5为在80℃、以0.10 g的PVP为分散剂、2.00 g的葡萄糖为还原剂、反应时间为4 h，不同硝酸银浓度条件下制备得到载银纳米微晶纤维素的紫外吸收光谱图。由图5可知，当硝酸银浓度为0.0125 mol/L时，生成浅黄色的纳米银颗粒，其紫外可见光谱吸收峰的位置在418 nm处（曲线a），对应的纳米银半峰宽较宽，表明生成的纳米银颗粒粒径分布较宽。当硝酸银浓度增加到0.1000 mol/L时，生成的纳米银粒子呈红棕色，其紫外可见光谱吸收峰的位置在415 nm处（曲线d）。晶体的形成是一个晶粒成核与生长的过程，通过控制成核速率和生长速率两者之间的平衡来调节晶体形貌和尺寸;当生长速率相对较小而成核速率相对较大时，可以生成粒径小的晶粒。当硝酸银浓度增加时，纳米银晶体的成核速率較大，生长速率小，生成的晶粒粒径较小。另外，随着硝酸银浓度的增加，纳米银颗粒紫外可见光谱吸收峰的强度也不断增强，由此可知，硝酸银浓度与纳米银颗粒的产量和粒径相关性很大，硝酸银浓度越大，纳米银颗粒的产量越高而粒径越小。

2.2 载银纳米微晶纤维素的抗菌性

纳米银是一种具有大比表面积和小粒径的纳米颗粒，可以快速吸附在细菌的细胞膜表面，影响细菌正常的生理功能（如呼吸功能等），从而快速杀死细菌[16]。此外，纳米银粒子可以通过渗透细菌的细胞膜，并与含有S、P等元素的大分子化合物（如核酸、RNA、DNA）作用的方式，抑制细菌的自我复制，从而杀死细菌。本实验以大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）作为实验菌种，采用抑菌圈法[17]对载银纳米微晶纤维素的抗菌性能进行检测。

在不同硝酸银浓度（0.0125、0.0250、0.0500、0.1000 mol/L）条件下制备载银纳米微晶纤维素。离心超声处理后，对E.coli和S.aureus进行抗菌性能检测，结果如表1和图6所示。

由表1和图6可知，将硝酸银浓度从0.0125 mol/L提高到0.1000 mol/L，抑菌圈会逐渐变大，说明高浓度硝酸银条件下生成的纳米银颗粒较多，其抑菌效果较明显。当硝酸银浓度为0.1000 mol/L时，抑菌圈直径较大，抑菌效果最明显，载银纳米微晶纤维素对大肠杆菌的抑菌圈直径最大为19.8 mm，其对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径最大为20.1 mm。综上所述，载银纳米微晶纤维素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。

3 结 论

以实验室自制的纳米微晶纤维素为载体、聚乙烯吡咯烷酮为分散剂和保护剂、葡萄糖为还原剂并与硝酸银反应以制备载银纳米微晶纤维素。所生成的纳米银颗粒直径在10～20 nm之间，无团聚现象，其在纳米微晶纤维素中分布均匀;X射线衍射分析结果表明，纳米银的结晶性能较好，其结构为多晶体系;随着反应时间的延长，纳米银颗粒的粒径不断减小，粒径分布不断变窄;随着葡萄糖用量增加，被还原的银离子越多，原子态的银聚集长大成核，形成纳米银;随着硝酸银浓度增加，纳米银晶体成核速率较大，生长速率小，生成的晶粒粒径较小。抑菌实验结果表明，随着硝酸银浓度增加，抑菌圈逐渐变大，表明载银纳米微晶纤维素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用。

参 考 文 献

[1] Zuo H J， Wen W H， Wu D C， et al. State-of-the-art of antibacterial polymers[J]. Chemical Industry and Engineering Progress， 2013， 32（3）： 604.

左华江， 温婉华， 吴丁财， 等. 高分子抗菌剂的研究现状[J]. 化工进展， 2013， 32（3）： 604.

[2] Liu Y B， Li Y F， Bai Y X. Research Status and Prospect of Polyme-ric Antimicrobial Material[J]. Materials Reports， 2010， 24（13）： 123.

刘耀斌， 李彦锋， 拜永孝. 高聚物抗菌材料的研究现状及展望[J]. 材料导报， 2010， 24（13）： 123.

[3] Le Z W， Ling X L， Yue X X. Research status and development trend of antimicrobial materials[J]. Chengdu Textile College， 2016， 33（2）： 58.

乐志文， 凌新龙， 岳新霞. 抗菌材料的研究现状及发展趋势[J]. 成都纺织高等专科学校学报， 2016， 33（2）： 58.

[4] Pei J C. Lignocellulosic Chemistry.[M]. 4th Ed. Beijing： China Light Industry Press， 2012.

裴继诚. 植物纤维化学[M]. 4版. 北京： 中国轻工业出版社， 2012.

[5] Wang H Y， Meng W， Liu Z M. Preparation and characterization of nanocrystalline cellulose/silver nanoparticles[J]. Journal of Functional Materials， 2013， 44（5）： 305.

王海英， 孟 围， 刘志明. 纳米纤维素/银纳米粒子的制备和表征[J]. 功能材料， 2013， 44（5）： 305.

[6] Song J H， Zheng X J. Preparation of Ultrafine Silver Powder by Reduction with Hydrogen Peroxide[J]. The Chinese Journal of Nonferrous Metals， 1998， 8（2）： 242.

宋建恒， 郑学军. 双氧水还原制备超细银粉[J]. 有色金属学报， 1998， 8（2）： 242.

[7] Kong M L， Gao G H， Chang X T， et al. Preparation of Silver Nanoparticles by the Liquid-phase Chemistry Reducing Method and Their Antimicrobial Properties[J]. Materials Reports， 2011， 25（9）： 51.

孔茉莉， 高冠慧， 常雪婷， 等. 液相化学还原法制备纳米银及抗菌性能研究[J]. 材料導报， 2011， 25（9）： 51.

[8] Liao X H， Zhu J J， Zhao X N， et al. Electrochemical synthesis of silver nanoparticles[J]. Chemical Journal of Chinese Universities， 2000， 21（12）： 1837.

廖学红， 朱俊杰， 赵小宁， 等. 纳米银的电化学合成[J]. 高等学校化学学报， 2000， 21（12）： 1837.

[9] Yang L， Lu S， Li J， et al. Nanocrystalline cellulose-dispersed AKD emulsion for enhancing the mechanical and multiple barrier properties of surface-sized paper[J]. Carbohydrate Polymers， 2016， 136： 1035.

[10] Sun B， Hou Q， He Z， et al. Cellulose nanocrystals （CNC） as carriers for a spirooxazine dye and its effect on photochromic efficiency[J]. Carbohydr Polym， 2014， 111（1）： 419.

[11] Ramaraju B， Imae T， Destaye A G. Ag nanoparticle-immobilized cellulose nanofibril films for environmental conservation[J]. Applied Catalysis A： General， 2015， 492： 184.

[12] Jin Z W， Wang J Q， Wang S， et al. Preparation of Cellulose/Ag+ Antibacterial Composites Films by NMMO-Technology[J]. Advanced Materials Research， 2011， 174： 458.

[13] Azizi S， Ahmad M， Hussein M， et al. Synthesis， Antibacterial and Thermal Studies of Cellulose Nanocrystal Stabilized ZnO-Ag Heterostructure Nanoparticles[J]. Molecules， 2013， 18（6）： 6269.

[14] Seabra A B， Lemes A P， Duran N. Review of cellulose nanocrystals patents： preparation， composites and general applications[J]. Recent Patents on Nanotechnology， 2012， DOI： 10. 2174/ 18722102798109255.

[15] Zhang Y Z， Dai K， Shi L Y， et al. Preparation and characterization of nanosize silver particles[J]. New Chemical Materials， 2006， 34（7）： 31.

張云竹， 代 凯， 施利毅， 等. 纳米银粒子的制备及其表征[J]. 化工新型材料， 2006， 34（7）： 31.

[16] Sharma V K， Yngard R A， Lin Y. Silver nanoparticles： green synthesis and their antimicrobial activities[J]. Adv Colloid Interface Sci， 2009， 145（1）： 83.

[17] Yang G， Xie J， Hong F， et al. Antimicrobial activity of silver nanoparticle impregnated bacterial cellulose membrane： effect of fermentation carbon sources of bacterial cellulose[J]. Carbohydrate Polymers， 2012， 87（1）： 839.

Preparation and Characterization of Silver-loaded Nanocrystalline Cellulose

FAN Li1 LIU PengtaoLIU Xinliang2

（1. Tianjin Key Laboratory of Pulp and Paper， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin， 300457;

2. Guangxi Key Laboratory of Clean Pulp & Papermaking and Pollution Control， Nanning， Guangxi Zhuang Autonomous Region， 530004）

（*E-mail：pengtaoliu@tust.edu.cn）

Abstract：The silver nanoparticles were prepared using nanocrystalline cellulose （NCC） as the carrier， PVP as the dispersant， glucose as the reducing agent， and silver nitrate as the source of silver. Then the silver-loaded nanocrystalline cellulose solution was prepared in situ and was characterized by UV-Vis spectrophotometer， transmission electron microscopy and X-ray diffractometer. The results showed that the average particle size of silver nanoparticles in the silver-loaded nanocrystalline cellulose system was 10～20 nm， which was crystal structure and uniformly dispersed， and had good antibacterial properties. The antibacterial performance of the silver-loaded nanocrystalline cellulose was tested by the bacteriostatic zone method and the system showed good inhibitory effects on E.coli and S.aureus.

Keywords：nanocrystalline cellulose; nano-silver; antibacterial