改性桑枝韧皮纤维素纳米协同抗菌剂的研究

王小燕 刘利 曾秀 谷山林 马群忠 熊定奎 王海燕

摘要： 为了克服无机抗菌剂纳米银易团聚的缺点，有效改善四环素长期使用产生的耐药性及副作用问题，以废弃桑枝韧皮为原料，采用化学方法去除果胶、木质素和半纤维素制备桑枝韧皮纤维素，用氯乙酸反应对桑枝韧皮进行表面改性，并将四环素以化学键形式牢固修饰在纤维素表面，纳米银成功负载在纤维素中，创造性地制备了载银改性桑枝韧皮纤维素（Ag T CMC）协同抗菌剂。试验结果表明：Ag T CMC呈现出优异的抗菌性能和较好的协同抗菌性，载银量在1.5%时抗菌性能最优;且对动物细胞无细胞毒性，有望实现在伤口敷料上的应用。

关键词： 桑枝韧皮;纤维素;纳米银;抗生素;耐药性;协同抗菌

Study on synergistic antibacterial agent of Ag carried tetracycline mulberry bast carboxymethyl cellulose

WANG Xiaoyan1， LIU Li2， ZENG Xiu1， GU Shanlin1， MA Qunzhong1， XIONG Dingkui1， WANG Haiyan1

（1.Chongqing Academic of Animal Science， Chongqing 402460， China;

2.Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection of Third Branch， Chongqing 402160， China）

Abstract： In order to overcome the shortcoming of inorganic antibacterial agent nano Ag easy to agglomerate， and effectively solve the drug resistance and side effects caused by the long term use of tetracycline， Ag modified mulberry bast fiber （Ag T CMC） synergistic antibacterial agent was creatively prepared by the following method and materials： discarded mulberry bast was used as the raw material， and pectin， lignin and hemicellulose were removed chemically to prepare mulberry bast cellulose; chloroacetic acid was used to modify mulberry bast， and tetracycline is firmly modified on cellulose surface in the form of chemical bond to successfully load nano Ag in cellulose. The results showed that Ag T CMC exhibited excellent antibacterial properties and good synergistic antibacterial properties. The antibacterial property was optimal when the Ag loaded quantity was 1.5%. Besides， it is not cytotoxic to animal cells， so it is expected to be applied to wound dressings.

Key words： mulberry bast; cellulose; nano Ag; antibiotic; drug resistance; synergistic antiseptic

四環素是一种广谱抗生素[1]，有较强的抗菌作用，但四环素进入人体内会产生很多副作用[2]，如导致牙黄和影响胃肠功能，并且长期使用容易使细菌产生耐药性[3];无机纳米抗菌剂较传统抗生素不存在耐药性问题[4]。其中纳米银抗菌效果最好，但是纳米银有易团聚的特点，且纳米银单独使用具有细胞毒性。为了克服单一抗菌剂的缺点，LIU等[4]首次制备出载银有机膦酸锆有机 无机协同抗菌剂，创造性地组合了有机抗菌剂和无机抗菌剂的优点，但其价格昂贵难以从应用上得到推广。

桑枝为桑园冬管的大宗副产物，量大且是制浆、制板的良好材料，其韧皮还可以提取纤维素进一步制备纳米纤维素。纳米纤维素具有较大的比表面积[5]，故具有较大的吸附能力，能够吸附纳米银等纳米颗粒，因此，纳米纤维素可以作为纳米银的载体。且纳米纤维素分子具有较多羟基官能团，能够用氯乙酸进行表面修饰得到化学活性更好的羧甲基纳米纤维素[6]，进而能够在纤维素表面修饰具有抗菌功能的官能团。制备出有机 无机协同抗菌剂，该抗菌剂既拥有有机抗菌剂的广谱抗菌性和无机抗菌剂的长效性等优点，能有效解决四环素长期使用产生的耐药性、副作用和无机抗菌剂易团聚的问题。

1 试 验

1.1 材料与试剂

桑枝（重庆市畜牧科学院蚕业研究所），无水乙醇、异丙醇、甲基异丙酮、氯乙酸、硝酸银、葡萄糖均为国产分析纯AR（成都市科龙化工试剂厂），牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉为生化试剂BR（北京奥博星生物技术有限责任公司），金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（青岛海博生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设備

恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司），SHZ D循环真空泵和DF 101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司），THC 10B数控超声波提取机（济宁天华超声电子仪器有限公司），Nicolet170SX傅立叶变换红外光谱仪（美国Madison公司），XRD 3D X射线衍射仪（北京普析通用仪器有限公司）。

1.3 羧甲基化纤维素的制备

将桑枝韧皮干燥后粉碎过60目筛，称取桑枝韧皮粉60g，加甲基异丙酮300mL，95%乙醇192mL，异丙醇60mL，去离子水48mL，于1000mL圆底烧瓶中。在温度60℃，功率600W提取120min，40℃恒温水浴保温3h，待完全沉淀后抽滤，95%乙醇洗涤去杂质，取滤饼50℃干燥得桑枝韧皮纤维素，取10g桑枝韧皮纤维素，400mL异丙醇，10mL 50%氯乙酸乙醇溶液于1000mL圆底烧瓶中，80℃恒温水浴2h，抽滤，无水乙醇洗涤去杂质，50℃干燥得羧甲基化纤维素（carboxymethyl cellulose， CMC）。

1.4 改性桑枝韧皮纤维素纳米协同抗菌剂的制备

取10g上述羧甲基化纤维素，加600mL 95%乙醇于1000mL圆底烧瓶中，待磁力搅拌分散均匀后，加入5g四环素，于室温条件下避光反应6h，抽滤，烘干得四环素 羧甲基韧皮纤维素（tetracycline carboxymethyl cellulose T CMC）;取5g上述四环素 羧甲基韧皮纤维素于500mL圆底烧瓶中，加250mL 95%乙醇，磁力搅拌分散均匀后加入0.1g硝酸银，室温搅拌反应2h后加入1mL 0.05g/mL的抗坏血酸乙醇溶液，搅拌反应0.5h后过滤干燥即得载银改性桑枝韧皮纤维素（Ag tetracycline carboxymethyl cellulose， Ag T CMC）协同抗菌材料。

1.5 抗菌性能评价

取具有代表性的两种细菌进行抗菌试验：即金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922。

抗菌性能测试通过二倍稀释法在96孔板上完成，由紫外 可见分光光度计来测试细菌生长状况，波长600nm测OD值，每个组重复测3次，结果取平均值。其中最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration， MIC）是指目标化合物可以杀死99%的细菌的最低浓度，通常以美国国家实验室标准委员会推荐的方法为标准[7]。选用革兰氏阳性、阴性菌各一种：即金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922评价制备的改性桑枝韧皮纤维素纳米协同抗菌材料的抗菌活性。

1.6 安全性评价

1.6.1 四环素释放测试

取1g抗菌性能最佳的Ag T CMC样品于半透膜中，将半透膜置于烧杯中，加入100mL、pH7.4的缓冲溶液搅拌，每隔1h用紫外 可见分光光度计在波长为350nm处测试溶液中四环素的浓度。

1.6.2 细胞毒性试验

T CMC和Ag T CMC体外细胞毒性试验测试细胞选用人体肺腺癌细胞（A549）。用细胞计数（cell counting Kit 8，CCK 8）法分析[8]，当有活细胞存在时CCK 8的主要成分2 （2 甲氧基 4 硝苯基） 3 （4 硝苯基） 5 （2，4 二磺基苯） 2H 四唑单钠盐（WST 8）会被还原为水溶性的黄色的甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，细胞的存活率通过紫外分光光度计在波长为450nm处的OD值检测。

2 结果与分析

2.1 结构分析

2.1.1 红外数据分析

桑枝韧皮纤维素、羧甲基化纤维素（CMC）、四环素 羧甲基韧皮纤维素（T CMC）的傅里叶红外光谱如图1所示。由图1可知，波长在3430cm-1处有较强的吸收峰，对应纤维素的━OH伸缩振动吸收峰，2900cm-1处的峰对应━C━H伸缩振动吸收峰，1635cm-1处的峰对应━C═O吸收峰，1060cm-1处的峰对应━C━O伸缩振动吸收峰，668cm-1处的峰对应━OH变形振动峰，以上共同构成了纤维素的红外光谱图。图1中，T CMC在1320cm-1处出现了特征吸收峰，该峰对应四环素中━C━N吸收峰，证明成功合成了四环素 羧甲基韧皮纤维素。

2.1.2 X射线衍射分析（XRD）

桑枝韧皮纤维素、T CMC、Ag T CMC的X射线衍射如图2所示。由图2可知，在2θ角为22.7°处有共同衍射峰，该峰对应纤维素[002]晶面衍射峰;图2中，Ag T CMC在2θ角为38.3°处出现一个较强的衍射峰，对应纳米银的[111]晶面的衍射峰，证明纳米银被成功负载。

2.1.3 透射电镜分析（TEM）

Ag T CMC的TEM表征如图3所示。从图3可以看见，纳米银颗粒均匀分布在纤维素之间，与X射线衍射分析相对应，证明成功负载了纳米银，纳米银平均尺寸约为20nm。

2.2 抗菌性能表征

2.2.1 MIC值

抗菌性能采用MIC值判定，納米银、T CMC、Ag T CMC的MIC值如表1所示，纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别是64μg/mL和128μg/mL[9]，Ag T CMC对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别是8μg/mL和16μg/mL，比单独的纳米银和T CMC的抗菌性能强。为了探索Ag T CMC中的最佳纳米银比例，做了不同纳米银含量的Ag T CMC的MIC值，结果如图4所示，随着纳米银含量的增大，MIC值先减小后增大，当纳米银含量在1.5%时达到最低。出现这种结果的原因，分析认为：开始，随着纳米银含量的增加，Ag T CMC的协同抗菌性能增强;但随着纳米银含量的增大，大于1.5%时，纳米银的尺寸变大，Ag T CMC的抗菌效果减弱。

2.2.2 协同抗菌性

分级抑菌浓度（fractional inhibitory concentration， FIC）用MIC值通过式（1）计算，当FIC≤0.5，为协同作用;当0.52，为拮抗作用[10 11]。不同纳米银含量的Ag T CMC的FIC值见表2，当纳米银含量为0.25%时Ag T CMC中的纳米银和T CMC无相关作用;随着纳米银含量增加到0.5%时，Ag T CMC中的纳米银和T CMC呈现出相加作用;当纳米银含量进一步增大，Ag T CMC中的纳米银和T CMC呈现出协同抗菌作用，且协同抗菌性变化趋势与抗菌性保持一致。

FIC=MIC0MIC1+MIC0MIC2（1）

式中：MIC0为Ag T CMC的MIC值，MIC1为T CMC的MIC值，MIC2为Ag NPS的MIC值。

2.3 安全性能表征

2.3.1 四环素释放表征

四环素进入人体会对人造成一定副作用，为了保证抗菌剂的安全性，Ag T CMC中的四环素必须牢固负载在纤维素上。为了探究Ag T CMC的安全性，模拟人体pH值环境（pH7.4）做四环素释放表征。四环素释放结果如图5所示，在5h前Ag T CMC缓慢释放出微量四环素，释放最大浓度为0.11μg/mL，当5h后四环素不再被释放。分析认为，这可能是大部分四环素与羧甲基化的纤维素以化学键牢固结合的同时，有微量四环素是被物理表面吸附在纤维素中，在溶液中微量四环素被释放出来。为了进一步探索四环素释放原因，取出释放24h的样品再次放入100mL缓冲溶液（pH7.4）中进行释放表征，在新的缓冲溶液中未检测出四环素，进一步证明猜想是正确的。

2.3.2 细胞毒性

图6为细胞毒性试验数据。从图6可以看出，当Ag T CMC的质量浓度达到256μg/mL时A549细胞存活率依然是100%，证明在该浓度下Ag T CMC对细胞活性也无毒性，进一步说明在Ag T CMC抗菌剂使用量的范围内对人体和动物是无细胞毒性的。

3 结 论

本研究制备的协同抗菌剂载银改性桑枝韧皮纤维素（Ag T CMC），载银比例在1.5%时Ag T CMC的抗菌性能最佳，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的MIC值分别是8μg/mL和16μg/mL，且该比例协同抗菌性最佳（FIC 0.125），四环素以化学键形式与纤维素牢固结合，在Ag T CMC的质量浓度达到256μg/mL时依然对A549细胞无细胞毒性。Ag T CMC优异的抗菌性能和良好的生物相容性，使得它在医药卫生领域尤其是伤口敷料上有潜在的应用价值。

参考文献：

[1]HUSSAIN T， JAMAL M， NIGHAT F， et al. Broad spectrum antibiotics and resistance in non target bacteria： an example from tetracycline [J]. Journal of Pure & Applied Microbiology， 2014， 8（4）： 2667 2671.

[2]GOLUB L M， RAMAMURTHY N S， MCNAMARA T F， et al. Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown： new therapeutic implications for an old family of drugs [J]. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine An Official Publication of the American Association of Oral Biologists， 1991， 2（3）：297.

[3]RANGASAMY K， ATHIAPPAN M， DEVARAJAN N， et al. Emergence of multi drug resistance among soil bacteria exposing to insecticides [J]. Microbial Pathogenesis， 2017， 105：153 165.

[4]LIU L， LIU C， NIE L， et al. Study on the synergistic antibacterial effect of silver carried layered zirconium alkyl N，N dimethylenephosphonate [J]. Inorganica Chimica Acta， 2015， 435：66 72.

[5]HADDADA R， FERJANI E， ROUDESLI M S， et al. Properties of cellulose acetate nanofiltration membranes：application to brackish water desalination [J]. Desalination， 2018， 167（167）： 403 409.

[6]NOSHIRVANI N， GHANBARZADEH B， MOKARRAM R R， et al. Preparation and characterization of active emulsified films based on chitosan carboxymethyl cellulose containing zinc oxide nano particles [J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2017， 99：530 538.

[7]薛峰， 李耘， 吕媛，等. 头孢硫脒最低抑菌浓度及其影响因素研究[J].中國临床药理学杂志，2018，34（1）：25 29.

XUE Feng， LI Yun， L Yuan， et al. Study on minimum inhibitory concentrations and its influence factors of cefathiamidine [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology， 2018，34（1）：25 29.

[8]TOWNSEND M， PECK C， MENG W， et al. Evaluation of various glyphosate concentrations on DNA damage in human Raji cells and its impact on cytotoxicity [J]. Regulatory Toxicology & Pharmacology， 2017， 85： 79 85.

[9]AGNIHOTRI S， MUKHERJI S， MUKHERJI S. Size controlled silver nanoparticles synthesized over the range 5 100 nm using the same protocol and their antibacterial efficacy [J]. Rsc Advances， 2013， 4（8）：3974 3983.

[10]FRATINI F， MANCINI S， TURCHI B， et al. A novel interpretation of the fractional inhibitory concentration index： the case origanum vulgare L and leptospermum scoparium J R et G Forst essential oils against staphylococcus aureus strains [J]. Microbiological Research， 2017， 195：11 17.

[11]ALHARBE R， ALMANSOUR A， KWON D H. Antibacterial activity of exogenous glutathione and its synergism on antibiotics sensitize carbapenem associated multidrug resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii [J]. International Journal of Medical Microbiology， 2017，307（7）：409 414.