产咖啡酸刺五加内生细菌CX15的鉴定及活性研究

摘 要：研究内生细菌CX15的活性作用及活性代谢物。采用HPLC法对CX15发酵液中活性代谢物进行分析;采用滤纸片法对内生细菌CX15进行抑菌活性研究;结合形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析对该菌株进行了鉴定。结果表明，内生细菌CX15发酵液中含有咖啡酸;同时，该菌株具有较好的抑菌活性;经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），说明内生细菌CX15为咖啡酸产生菌，该菌可能与宿主植物刺五加具有相同的代谢机制。

关键词：内生细菌;抑菌活性;鉴定;咖啡酸

中图分类号：R932; Q939.97

文献标识码：A

刺五加（Acanthopanax sentcosus（Rupr.et Maxim.）Harms）为北方濒危药用植物[1]，具有抗肿瘤[2]，抗氧化、免疫调节[3]，抗抑郁[4]、降血糖[5]等作用，现广泛应用于食品、药品领域[6]，其主要活性成分为黄酮类、简单苯丙素类、有机酸类、香豆素类、三萜皂苷类、氨基酸类以及其他类化合物[7]。

本文基于内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中形成了互惠共生关系理论，即：宿主植物为内生菌生长发育提供必需的生态环境，避免外界生物或非生物的干扰等[8];同时，内生菌代谢产物能够刺激植物生长发育，提供宿主植物对环境胁迫的抵抗能力[9]，刺激宿主产生各种次生代谢产物以维护机体的健康[10]。以刺五加内生细菌CX15为研究对象，对其发酵液中次生代谢产物进行分析;同时也开展活性研究;并对其进行了菌种鉴定。为综合利用该菌株，采用微生物发酵法生产刺五加活性成分奠定基础。

1材料与方法

1.1 菌种与培养

供试菌：刺五加内生细菌CX15（黑龙江大学生物制药专业实验惠赠）。

NA培养基由牛肉膏、蛋白胨、氯化钠组成;PDA培养基由马铃薯、葡萄糖组成[11]。

16Sr DNA序列扩增引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2仪器与试剂

高效液相色谱仪（FL2 200型，浙江温岭）。

试剂：甲醇为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.3内生细菌CX15发酵液供试品的制备

取已活化的CX15菌株接种于NA液体培养基中，120r/min，37℃振荡发酵培养5d，取出，于2000r/min离心10min，得发酵液，冻干，备用。

1.4内生细菌CX15发酵液分析

采用HPLC法对CX15菌株发酵液中活性成分进行分析。取内生细菌CX15发酵液分析供试品液，甲醇溶解，微孔滤膜过滤（ 0.45um），取滤液作为供试品溶液。分别精密吸取0.5mg/mL咖啡酸对照品液及供试品液各10uL注入色谱仪，色谱柱：Venusil XBP-C18柱;流动相：甲醇-水-磷酸（30：70： 0.2）;流速：1 mL/min;检测波长：254nm。

1.5抑菌活性检测

取内生细菌CXl-5发酵液的供试品，以适量甲醇溶解成1mg/mL的供试品液，过滤（0.22um无菌滤器），采用滤纸片法[12]，进行抑菌活性测定。

1.6内生细菌CX15菌株鉴定

1.6.1内生细菌CX15形态学观察及生理生化指标测定

形态学鉴定主要观察内生细菌CXl5菌株的菌落、细胞形态，革兰氏染色，有无鞭毛等;生理生化测定主要选取以下微生物常用的指标进行鉴定：生长温度的测定，需氧性的测定，耐盐性的测定，耐酸碱度的测定，生长曲线的测定，淀粉水解反应，明胶液化试验，酶的测定，甲基红试验，运动性试验等[13]。

1.6.2 16S rDNA序列扩增和序列分析

利用細菌16S rDNA基因的通用引物对内生细菌CX15菌株进行PCR扩增，对扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与GenBank中相关菌株的16S rDNA序列进行同源性分析，并利用最大简约法构建16S rDNA系统进化树[14]。

2结果与分析

2.1 内生细菌CX15发酵液分析结果

通过HPLC法，以咖啡酸为对照，对CX15发酵液中活性成分进行分析，在CX15发酵液中检测到咖啡酸，而阴性对照（培养基）无干扰;同时CX15发酵液中色谱峰采用对照品加入法，得到了较好的确认，其结果如图1及图2所示;同时，在CX15发酵液中还存在与刺五加生药相同的未知成分x，说明在CX15发酵液中含有大量的与宿主植物刺五加相同或相似的活性代谢物。

2.2抑菌活性检测结果

刺五加内生细菌CX15发酵液对11种致病菌均有不同程度的抑制作用，结果见表1。

2.3内生细菌CX15菌株鉴定结果

2.3.1内生细菌CX15菌株形态学观察及生理生化指标测定结果

CX15菌株形态学观察及生理生化指标测定结果见表2。

2.3.2 16S rDNA序列扩增和序列分析结果

CX15菌株PCR扩增后得到1条1603bp的特异性条带，通过GENBANK比对，CX15（登录号为：JQ756968）与枯草芽孢杆菌KT873853.1序列相似性达到92%，综合生理生化和16S rDNA基因序列的分析结果，初步鉴定菌株CX15为枯草芽孢杆菌（Bacillus suhtilis）。菌株CX15系统发育树见图3。

3结论

本研究对刺五加内生细菌CX15发酵液进行初步分析，发现在刺五加内生细菌CX15发酵液中存在与宿主植物刺五加相同的活性成分咖啡酸，说明内生细菌CX15为咖啡酸产生菌;同时也说明刺五加内生细菌CX15在次生代谢产物产生机制方面与宿主植物刺五加有着相似之处。为了深入开发应用内生细菌CX15，对其进行了抑菌活性研究，也同时对其进行了菌株鉴定。若开展系统提取分离法，对CX15发酵液中咖啡酸等活性代谢物进行分离、鉴定等研究将具有重要意义。以CX15为发酵菌株，开展微生物发酵法生产咖啡酸原料及CX15菌株的综合利用研究工作还在继续进行中。

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作者簡介 ：康勋 （ 1978- ），男，江省滨人，高级艺师，现从事业技术推广与服务工作。