狼疮合剂的质量控制研究

2019-09-10车晓平王天园王宏韩旭阳彭冰曾祖平

世界中医药 2019年1期

车晓平王天园王宏韩旭阳彭冰曾祖平

摘要目的：建立狼疮合剂的质量控制标准。方法：对狼疮合剂中淫羊藿、鸡血藤、黄芪、白术进行薄层色谱法定性鉴别，对君药秦艽含有的龙胆苦苷进行高效液相色谱法含量测定。结果：薄层色谱图特征斑点清晰、分离较好，阴性对照无干扰;龙胆苦苷在0.202 5～3.24 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，平均加样回收率为102.56%，RSD=1.57%（n=6），3批狼疮合剂中龙胆苦苷平均含量为1.70 mg/mL。结论：本法准确、灵敏，重复性好，为狼疮合剂的质量控制提供了依据。

关键词狼疮合剂;龙胆苦苷;高效液相色谱法;薄层色谱法

中图分类号：R283文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.015

系统性红斑狼疮是自身免疫介导的、累及全身各个系统，以免疫性炎性反应为突出表现的弥漫性结缔组织病[1]，《中药新药临床研究指导原则》将系统性红斑狼疮分为热毒炽盛、阴虚内热、瘀热痹阻、风湿热痹、脾肾阳虚、肝肾阴虚、气血两虚等7个证型[2]，中医临床根据患者病情辨证治疗。狼疮合剂为首都医科大学附属北京中医医院院内制剂，由黄芪、秦艽、党参等11味中药组成，功效为健脾益肾、活血解毒通络，用于脾肾两虚引起的红斑狼疮，有较好的疗。

狼疮合剂的原质量标准仅对黄芪进行了薄层色谱鉴别，为了保障临床用药的安全性和有效性。本研究采用薄层色谱法建立了鸡血藤、白术、淫羊藿、黄芪的定性鉴别标准，并对君药秦艽含有的龙胆苦苷进行高效液相色谱法含量测定。

1材料

1.1仪器GT101高速离心机（北京时代北利离心机有限公司），H.H.S21.4电热恒温水浴锅（上海医疗器械三厂），XS205电子天平（METTLER TOLEDO），SK7210HP超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司），YOKOZS薄层色谱成像仪、YOKOPX喷雾显色抽气箱、YOKOPN电动喷雾器（武汉药科新技术开发有限公司），Agilent 1100高效液相色谱仪（Agilent）。

1.2试剂硅胶G薄层板、硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工厂分厂），0.22 μm微孔滤膜（津腾），所用试剂均为分析纯（北京化学试剂公司）。

1.3分析样品狼疮合剂处方饮片（北京杏林药业有限责任公司）;狼疮合剂（首都医科大学附属北京中医医院;批号：20140707、20140708、20140709）;鸡血藤对照药材（121173200902），白术对照药材（120925200708），龙胆苦苷对照品（110770201013），淫羊藿苷对照品（7379203），黄芪甲苷对照品（7819202），均购于中国药品生物制品检定所。

2方法与结果

2.1狼疮合剂中鸡血藤、白术、淫羊藿、黄芪的薄层色谱鉴别[34]

2.1.1鸡血藤的薄层色谱鉴别取狼疮合剂20 mL，每次加入乙醚20 mL振摇提取2次，将乙醚液合并、蒸干，用乙酸乙酯1 mL将残渣溶解，作为供试品溶液。按狼疮合剂制备工艺配制无鸡血藤的空白合剂，同法制得不含鸡血藤的阴性对照品溶液。另取鸡血藤对照药材3 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷后滤过，所得滤液按供试品溶液制备方法制得鸡血藤对照药材溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法[6]，分别吸取上述鸡血藤阴性对照品溶液与供试品溶液各10 μL、鸡血藤对照药材溶液5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展开，取出并晾干，以三氯化铝溶液喷雾显色，置365 nm紫外光灯下进行检视。在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰[5]。见图1。

2.1.2白术的薄层色谱鉴别按狼疮合剂制备工艺配制无白术的空白合剂，照2.1.1项下供试品溶液制备方法制得不含白术的阴性对照品溶液。取白术对照药材0.5 g，加乙醚20 mL进行超声处理20 min，滤过后将滤液蒸干，用甲醇2 mL将残渣溶解作为白术对照药材溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法，分别吸取白术阴性对照品溶液及2.1.1中供试品溶液各10 μL、白术对照药材溶液5 μL，点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂正己烷乙酸乙酯甲苯（5∶2∶1）展开，取出并晾干，以对二甲氨基苯甲醛试液喷雾显色，热风吹干后置365 nm紫外光灯下检视。在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性样品无干扰[7]。见图2。

2.1.3淫羊藿的薄层色谱鉴别将2.1.1中剩余的水层每次用乙酸乙酯20 mL振摇提取2次，将乙酸乙酯液合并蒸干，用甲醇1 mL将残渣溶解，作为供试品溶液。按狼瘡合剂制备工艺配制无淫羊藿的空白合剂，照供试品溶液制备方法制得不含淫羊藿的阴性对照品溶液。另取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg淫羊藿苷的对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法，分别吸取淫羊藿阴性对照品溶液及供试品溶液各10 μL、淫羊藿苷对照品溶液2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂丁酮甲酸乙酸乙酯水（1∶1∶10∶1）展开，取出，晾干，以三氯化铝试液喷雾显色，置365 nm紫外光灯下检视。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰[8]。见图3。

2.1.4黄芪的薄层色谱鉴别将2.1.3中剩余的水层用水饱和正丁醇振摇提取2次，20 mL/次，合并正丁醇液，依次用氨水、正丁醇饱和水洗涤1次，30 mL/次，蒸干正丁醇液，用甲醇1 mL将残渣溶解，作为供试品溶液。按狼疮合剂制备工艺配制无黄芪的空白合剂，照供试品溶液制备方法制得不含黄芪的阴性对照品溶液。另取黄芪甲苷对照品适量，加乙醇制成每1 mL含1 mg黄芪甲苷的对照品溶液。按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法，分别吸取黄芪阴性对照品溶液及供试品溶液各10 μL、黄芪甲苷对照品溶液2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，用展开剂甲醇三氯甲烷水（7：13：2）的下层溶液展开，取出并晾干，以10%硫酸乙醇溶液喷雾，加热至清晰显色出斑点。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点;365 nm紫外光灯下显相同颜色的荧光斑点;阴性样品均无干扰[9]。见图4。

2.2狼疮合剂中龙胆苦苷的含量测定[1011]

2.2.1色谱条件色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱;流动相：0.1%甲酸乙腈（90∶10）;检测波长：270 nm;柱温：室温;流速：1.0 mL/min。

2.2.2对照品溶液的制备取龙胆苦苷对照品20.25 mg精密称定，加甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3阴性对照品溶液的制备按制剂工艺制备不含秦艽的空白合剂，取5 mL置于25 mL容量瓶中，加水至刻度，定容，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4供试品溶液的制备精密量取离心后的狼疮合剂上清液1 mL，置25 mL容量瓶中，加水20 mL，超声5 min，加水定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得。

2.2.5专属性试验精密吸取秦艽阴性对照品溶液、龙胆苦苷对照品溶液与狼疮合剂供试品溶液各10 μL，分别进样。龙胆苦苷与其他组分可达到基线分离，阴性对照无干扰。见图5。

2.2.6线性关系考察将对照品溶液分别进样0.5、1、2、4、6、8 μL，依照2.2.1色谱条件测定峰面积。以横坐标为龙胆苦苷进样量（X）、纵坐标为峰面积积分值（Y）制作标准曲线，获得龙胆苦苷线性回归方程Y=1 255.2X1.306 7（r=0.999 99，n=6）。结果表明，在0.202 5～3.24 μg范围内，龙胆苦苷进样量与峰面积积分值线性关系良好。

2.2.7中间精密度试验取相同供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，测定龙胆苦苷峰面积积分值，计算龙胆苦苷含量，结果RSD为1.37%（n=6），表明所用仪器的精密度良好。

2.2.8供试品溶液稳定性试验取相同供试品溶液，在0、2、4、6、8 h每次进样10 μL，测定龙胆苦苷峰面积积分值，计算龙胆苦苷含量，结果RSD=0.89%（n=5），表明龙胆苦苷在供试品溶液中8 h内稳定。

2.2.9重复性试验分6次精密吸取相同批号狼疮合剂，每次1 mL，按2.2.3项下供试品溶液制备方法制备，进样10 μL，测定龙胆苦苷峰面积积分值，计算含量，结果龙胆苦苷平均含量1.767 mg/mL，RSD=1.23%（n=6），表明龙胆苦苷的含量测定方法重复性良好。

2.2.10回收率试验精密吸取已知含量的样品0.5 mL，共6份，置于25 mL量瓶中，分别精密加入浓度为0.405 mg/mL的对照品溶液3 mL，加水15 mL，超声5 min，加水定容至25 mL，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，即得供试液。精密吸取供试液10 μL，依法测定，计算，结果平均回收率为102.56%，RSD=1.57%（n=6）。见表1。

2.2.11耐用性试验选择2种不同品牌色谱柱，分别为kromasil 1005c18 150 mm×4.6 mm;Agilent ZORBAX Eclipse XDBC18 2.1 mm ×150 mm，依法测定同一批号样品。结果表明，使用2种不同品牌的色谱柱，供试品溶液中龙胆苦苷峰均能达基线分离，分离度符合要求，测定结果不受影响，方法耐用性良好。

2.2.12样品测定结果取3批次狼疮合剂，按2.2.3项下分别制成供试品溶液，依照2.2.1色谱条件每批次进样10 μL测定龙胆苦苷含量。见表2。

3讨论

3.1薄层色谱鉴别对处方中其他药味也进行了薄层色谱研究。1）鉴别党参[12]时，供试液曾经尝试用2.1.4中的供试品溶液、氨水洗涤液部分或正丁醇饱和水洗涤液部分;采用正丁醇冰醋酸水（7∶1∶0.5）、三氯甲烷甲醇水（13∶7∶2）的下层溶液等做展开剂。结果供试品中与党参炔苷对应位置斑点均不清晰，未收载于正文。2）鉴别拳参[13]时，以绿原酸、没食子酸和拳参药材作为阳性对照，考察展开剂二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）、乙酸丁酯甲酸水（7∶2.5∶2.5）上层。结果2.1.3中供试品与绿原酸似有对应斑点，而在与没食子酸相应位置阴性有干扰。此鉴别特异性不强，未收载于正文。3）鉴别女贞子时，曾经尝试《中华人民共和国药典》收载方法[13]，结果供试品中与齐墩果酸对应位置无明显斑点;将女贞子药材水煎后依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇振摇提取、浓缩后作为阳性对照，结果乙酸乙酯部分在二氯甲烷乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）的展開条件下，与没食子酸相应位置阴性有对应斑点，表明二者相互干扰，未收载于正文。4）鉴别丹参时，考虑制剂的工艺特点，选择鉴别丹参中的水溶性成分。以2.1.3项下供试液采用药典方法[13]鉴别丹酚酸B，效果不佳。后参考文献方法[14]，取丹参药材1.5 g，加水20 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液用盐酸调pH约为2，其余同2.1.3供试品溶液制备，得到丹参对照药材溶液;并按处方比例，称取除丹参以外的其他饮片，按成品制备工艺制成空白制剂，再按2.1.3项下供试液制备方法制备，得丹参阴性对照溶液;以甲苯乙酸乙酯甲酸（5∶4∶1）为展开剂、3%三氯化铁乙醇液为显色剂，结果主斑点阴性有干扰。未收载于正文。

3.2含量测定秦艽既能外散风湿舒筋活络，又能内泄湿热、凉血退蒸，为风药中之润剂，散药中之补剂，具有抗炎、抗氧化、调节免疫中枢系统、保肝、升血糖等广泛的药理活性[15]，在狼疮合剂中为君药。秦艽中主要有效成分为龙胆苦苷，为《中华人民共和国药典》中规定的含量测定成分[13]。

根据文献以及药典中龙胆苦苷的含量测定方法，实验中考察了甲醇水（25∶75）、0.1%甲酸乙腈（90∶10）2种流动相，使用甲醇水（25∶75）的流动相分离效果不好，故舍弃。考察了270 nm、254 nm 2种波长，比较后得出在波长270 nm下达到最大吸收，且分离效果好，阴性无干扰，故选择波长270 nm。

狼疮合剂的薄层色谱鉴别和含量测定方法重现性好，简便易行，为安全有效的用药提供了一个合理依据，可较好地控制狼疮合剂的质量。

参考文献

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