人参皂苷Rb1对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖利用及AMPK信号通路相关基因表达的影响

赵丹丹 吴瑞 白颖 莫芳芳 马如风 柳辰玥 朱如愿 左加成 姜广建

摘要目的：观察人参皂苷Rb1对胰岛素抵抗（IR）的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖利用的影响，并基于AMPK信号通路探讨其可能的作用机制。方法：将C2C12细胞分为正常组、模型组、人参皂苷Rb1组，模型组以0.25 mmol/L棕榈酸，1%小牛血清白蛋白培养16 h诱导IR，人参皂苷Rb1组在模型组的基础上以1、3、10、30、100 μmol/L浓度的人参皂苷Rb1分别干预24 h和48 h，通过检测培养液中的葡萄糖含量反映葡萄糖消耗量，并应用CCK8试剂盒及光镜观察不同浓度人参皂苷Rb1对C2C12细胞活性及形态的影响，实时荧光定量PCR扩增分析人参皂苷Rb1对C2C12细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因表达的影响。并应用shRNA沉默AMPKα的表达，构建AMPKα低表达的骨骼肌细胞模型，以1、3、10、30、100 μmol/L浓度的人参皂苷Rb1分别干预24 h和48 h，与不含人参皂苷Rb1的培养液比较，再次验证人参皂苷Rb1对C2C12细胞葡萄糖利用的影响及其与AMPK信号通路的关系。结果：1、3、10、30 μmol/L人参皂苷Rb1对C2C12细胞形态及活性无显著影响，而100 μmol/L人参皂苷Rb1造成C2C12细胞活性降低及部分细胞死亡。10，30 μmol/L人参皂苷Rb1能够促进IR的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗量，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），且人参皂苷Rb1能够上调C2C12细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表达（P<0.05）。10、30 μmol/L人参皂苷Rb1亦能增加AMPKα低表达的骨骼肌细胞的葡萄糖消耗量（P<0.05），而该作用程度低于其对棕榈酸诱导的C2C12细胞IR的影响，且RTPCR结果显示人参皂苷Rb1能上调AMPKα低表达的C2C12细胞SIRT1、PGC1α的基因表达。结论：人参皂苷Rb1能够有效促进IR的C2C12骨骼肌细胞葡萄糖消耗，该作用与调节AMPK信号通路有关，但除AMPK信号通路亦有其他作用途径。

关键词人参皂苷Rb1;C2C12骨骼肌细胞;胰岛素抵抗;基因沉默;葡萄糖消耗;AMPK信号通路

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.011

胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）造成的葡萄糖摄取及利用障碍，是2型糖尿病等多种代谢相关疾病的中心环节[1]。骨骼肌细胞是参与机体葡萄糖等能量物质代谢的重要外周组织，在维持体内葡萄糖动态平衡及外周组织的胰岛素敏感性中发挥着关键作用[2]。降糖消渴颗粒乃肝脾肾三脏同调的组方，临床用于治疗糖尿病疗效确切，且离体研究亦证实降糖消渴颗粒含药血清具有促进C2C12细胞葡萄糖摄取及利用的作用[3]。文獻报道显示，该方的主要健脾益气组分人参皂苷Rb1能够改善糖尿病大鼠骨骼肌组织的胰岛素敏感性[4]，亦能促进脂肪细胞能量代谢[5]，其作用途径可能与调节瘦素受体、脂联素受体，葡萄糖转运蛋白等有关[68]。单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是机体细胞能量代谢的重要激酶，能够调节线粒体能量物质的代谢，应用shRNA沉默AMPK基因构建稳定的AMPK低表达的细胞株[9]，可以造成细胞对葡萄糖摄取及利用障碍[10]，用于胰岛素抵抗的相关研究。本研究将通过棕榈酸诱导的和AMPKα低表达的2种IR细胞模型，进一步观察降糖消渴颗粒中主要健脾益气组分人参皂苷Rb1对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖利用及AMPKα等基因表达的影响，从分子水平探析其对骨骼肌葡萄糖利用的情况及可能机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株C2C12骨骼肌细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院细胞资源中心。

1.1.2药物人参皂苷Rb1（曼思特，纯度≥98%）购自北京百诺威生物科技有限公司。

1.1.3试剂与仪器DMEM培养基，胰蛋白酶，均购自GIBCO公司;胎牛血清（杭州四季青）、青/链霉素，购自百诺威生物科技有限公司;棕榈酸、小牛血清白蛋白，购自Sigma公司;葡萄糖氧化酶法测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;CCK8试剂盒，购自于碧云天生物技术有限公司;Trizol试剂购自于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自于美国Thermo公司，Power SYBR Green PCR Master Mix购自于美国ABI公司。BMG全波长酶标仪（德国BMG LABTECH公司），逆转录PCR仪（美国Thermo公司），实时荧光定量PCR仪器7500型（美国ABI公司）。PCR扩增引物：AMPKα，沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1），过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α（PGC1α）由上海生工公司合成。引物序列如下：AMPKα上游引物AAACCCACAGAAATCCAAACAC，下游引物CCTTCCATTCATAGTCCAACTG;SIRT1上游引物GCAACAGCATCTTGCCTGAT，下游引物GTGCTACTGGTCTACAAG;PGC1α上游引物CCCTGCCATTGTTAAGACC，下游引物TGCTGCTGTTCCTGCTCCT。

1.2方法

1.2.1细胞培养与传代C2C12骨骼肌细胞以含10%胎牛血清（FBS），100 IU/mL青霉素，100 IU/mL链霉素的DMEM基础培养基于37 ℃，5%CO2条件下无菌培养。当细胞融合至80%左右时用0.25%胰酶进行消化并传代，每2～3 d传代1次。

1.2.2胰岛素抵抗细胞模型的建立及鉴定方法同前期实验，具体如下：C2C12细胞以104/mL接种于96孔板，每6孔1组，分别加入正常培养液及含0.25 mmol/L棕榈酸，1%小牛血清白蛋白的DMEM培养基，培养16 h后观察，若其葡萄糖消耗量明显下降，则表明IR模型建立成功[3]。

1.2.3AMPKα低表达的骨骼肌细胞模型的建立首先应用绿色荧光蛋白质粒电转C2C12细胞，摸索最佳的电转条件，并确定嘌呤霉素的药杀浓度。根据AMPKα基因信息（GeneID：105758），构建shRNA沉默点，设计并合成AMPKα基因shRNA靶位点，将AMPKα基因shRNA克隆至定点整合表达载体上，转入大肠杆菌后抽提质粒测序，使质粒达到电转级别;电转C2C12细胞，根据沉默效果筛选阳性克隆及摸索好的电转条件，将靶向性oligo和shRNA定点整合载体同时电转C2C12细胞。经药杀后，realtime PCR验证确定阳性克隆数量及过表达倍数;完成AMPKα低表达C2C12细胞株建立，用于后续人参皂苷Rb1的干预研究。

1.2.4干预方法将20 mg人参皂苷Rb1，溶解于适量DMSO中，0.22 μm滤膜过滤后作为贮存液。使用时用完全培养基进行稀释，分为5个剂量组，将终浓度分别为1、3、10、30、100 μmol/L的人参皂苷Rb1分别干预IR的C2C12细胞和AMPKα低表达的C2C12细胞，空白组给予含有等体积DMSO正常培养基进行均一化对照，每组设5个复孔，药物干预24 h、48 h。

1.2.5葡萄糖消耗量、细胞增殖检测及细胞形态的观察分别在给药干预24 h、48 h时取培养基上清20 μL/孔，按GODPOD法，依照葡萄糖氧化酶法测定试剂盒中的步骤进行检测。绘制标准曲线并根据公式及稀释倍数计算葡萄糖的浓度（mmol/L），通过比较培养液中葡萄糖的浓度，即可得知各组中细胞葡萄糖消耗量。按照CCK8试剂盒说明，分别将不同药物浓度干预24 h、48 h后，每孔加入10 L CCK8溶液，将培养板在培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光毒，记录OD值，观察不同浓度药物对细胞增殖的影响，并用于校正葡萄糖消耗量检测时的细胞数。并用光学显微镜进行拍照，观察不同浓度药物对细胞形态的影响。

1.2.6逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测将C2C12细胞及AMPKα低表达的C2C12细胞中，分别加入中浓度人参皂苷Rb1（1、3、10、30、100 μmol/L）干预24 h后，分别设置空白对照组，每组4个样本复孔，使用Trizol试剂抽提总RNA并定量，取总RNA 1 μg使用Oligo（dT）引物逆转录成第一链cDNA。进一步以SYBR MIX（10 μL）+cDNA模板（2 μL）+上/下游引物（各1 μL）+无核酸酶超纯水（6 μL）的反应体系，上荧光定量PCR仪进行扩增反应，95 ℃预变性2 min，继以95 ℃变性20 s，退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此反复40个循环后，结束后4 ℃保存。每个样品设立2个复孔重复。以GAPDH为内参进行标准化，结果以相对mRNA水平表示（2-ΔΔCt法），

1.3统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计量数据均使用（Mean±SEM）形式表示，多组数据比较采用方差分析（ANOVA），两两比较采用Dunnett法或独立样本t检验进行，以P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPadPrism6软件进行数据管理并制图。

2结果

2.1对IR的C2C12细胞形态及活力的影响如图1所示，应用前法构建IR模型，并加入不同浓度的人参皂苷Rb1干预48 h，光镜下观察低浓度（1、3、10、30 μmol/L）人参皂苷Rb1对C2C12骨骼肌细胞形态无显著影响，100 μmol/L的人参皂苷Rb1组细胞生长略缓慢，细胞数有所减少，培养基中出现部分死亡的细胞。CCK8检测亦显示，人参皂苷Rb1干预48 h后，除100 μmol/L以外，其他低浓度人参皂苷Rb1对骨骼肌活力影响差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2对IR的C2C12细胞模型葡萄糖消耗的影响由图2可见，与正常C2C12细胞比较，加入棕榈酸的C2C12细胞的培养液中剩余葡萄糖浓度明显升高，葡萄糖消耗量均明显降低（P<0.05），提示IR细胞模型构建成功。与无药物干预的IR细胞比较，除100 μmol/L外，不同浓度的人参皂苷Rb1（1、3、10、30 μmol/L）干预24 h、48 h，葡萄糖消耗量均有一定程度的增加，且呈现了一定的剂量依赖性，其中干预24 h时，10 μmol/L和30 μmol/L组干预细胞的葡萄糖消耗量分别增加了82.23%和83.13%，干预48 h时10 μmol/L和30 μmol/L组干预细胞的葡萄糖消耗量分别增加了87.50%和100.50%，与不加入人参皂苷Rb1的对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3对IR的C2C12细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因的影响与对照组IR的C2C12细胞比较，10 μmol/L人参皂苷Rb1能够显著上调细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表达（P<0.05）。说明人参皂苷Rb1促进葡萄糖消耗的作用可能與调节上述基因有关。见图3。

2.4对AMPKα低表达的C2C12细胞模型葡萄糖消耗的影响如图4所示，与不经药物干预的AMPKα低表达的C2C12细胞比较，除100 μmol/L外，不同浓度的人参皂苷Rb1（1、3、10、30 μmol/L）干预24 h、48 h，葡萄糖消耗量均有显著的增加（P<0.05）。其中干预24 h时，10 μmol/L和30 μmol/L组干预细胞的葡萄糖消耗量分别增加了61.14%和76.29%，干预48 h时，10 μmol/L和30 μmol/L组干预细胞的葡萄糖消耗量分别增加了58.86%和65.54%，与不加入人参皂苷Rb1的对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。人参皂苷Rb1对AMPKα低表达的IR细胞的葡萄糖消耗量的影响程度低于对棕榈酸诱导的IR细胞的影响，该结果进一步说明人参皂苷Rb1促进C2C12细胞葡萄糖消耗的与调节AMPKα有关。

2.5對AMPKα低表达的C2C12细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因的影响与对照组IR的C2C12细胞比较，10 μmol/L人参皂苷Rb1能够显著上调AMPKα低表达的C2C12细胞SIRT1、PGC1α的基因表达（P<0.05），对AMPKα的低表达细胞株的AMPKα基因表达有一定的上调作用，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。可见AMPKα基因沉默影响了人参皂苷Rb1对AMPKα的影响，但对SIRT1、PGC1α基因的影响仍存在，说明人参皂苷Rb1促进AMPKα低表达的C2C12细胞葡萄糖消耗的作用可能不仅仅通过调节AMPKα基因来完成。

3讨论

人参用于治疗糖尿病历史悠久，早在《本草纲目》中就有过记载。现代研究证明，人参中抗糖尿病作用的有效成分主要有人参皂苷，人参多肽，人参多糖等，其中人参皂苷是人参药理活性最重要的成分[1112]。其抗糖尿病的作用机制包括抑制食欲，降低肠道葡萄糖与脂肪的吸收;调节糖脂代谢通路，增加能量消耗;调节过氧化物酶体增殖剂活化受体γ活性和表达，改善IR;促进胰岛素分泌和抗胰岛β细胞凋亡;抗氧化应激和抗炎作用等[1314]。

人参皂苷Rb1是二醇组皂苷的主要成分之一，我们前期研究发现人参皂苷Rb1能够改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性，该作用可能与促进白色脂肪组织棕色化有关[15]。也有文献报道其具有促进脂肪细胞、骨骼肌细胞等胰岛素敏感细胞葡萄糖摄取的作用[8，16]，该作用与调节葡萄糖转运子4（GLUT4）的表达有关[8]，然其上游是否与调节AMPKα等因子相关却尚待深入研究。

在本研究中，我们观察到一定浓度的人参皂苷Rb1（10、30 μmol/L）能够促进高糖高脂诱导的IR的C2C12骨骼肌细胞的葡萄糖消耗，但过高剂量100 μmol/L因影响细胞活性而降低了葡萄糖的利用，且人参皂苷Rb1能够上调IR的C2C12骨骼肌细胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表达。PGC1α参与骨骼肌葡萄糖摄取及胰岛素敏感性的调节[17]，可以通过激活下游靶基因NRF1，NRF2等增强线粒体的生物合成，提高细胞线粒体数量和氧化呼吸功能[18]，与机体葡萄糖的消耗密切相关。而AMPK和SIRT1是PGC1α的重要上游调节因子，AMPK一方面可以直接磷酸化PGC1α相关位点增强PGC1α的转录活性，另一方面AMPK亦能通过提升胞内NAD+水平增强SIRT1的活性，从而以去乙酰化的方式调节SIRT1下游靶蛋白PGC1α的活性[19]。我们的研究结果表明人参皂苷Rb1调节骨骼肌细胞葡萄利用与AMPK信号通路有关，该发现与既往研究结果一致[4]。

此外，我们进一步通过构建AMPKα基因沉默的细胞株，进一步验证人参皂苷Rb1促进骨骼肌细胞葡萄利用与AMPK信号通路的关系。结果显示人参皂苷Rb1（10、30 μmol/L）亦能促进AMPKα低表达细胞株的葡萄糖消耗情况，但其促进作用较在棕榈酸诱导的IR的细胞中发挥的作用弱，且在AMPKα低表达细胞株中，较低浓度（1、3 μmol/L）人参皂苷Rb1也显示了一定的促进葡萄糖消耗的作用。此外，PCR结果提示人参皂苷Rb1对AMPKα基因沉默的细胞株SIRT1、PGC1α基因亦有上调作用。总之，本研究结果证实了参皂苷Rb1促进骨骼肌细胞葡萄利用与AMPK信号通路的有关，但不是单纯通过AMPK信号通路发挥作用，亦有其他信号通路发挥着调节作用。

综上所述，靶组织中葡萄糖摄取是维持的机体血糖水平关键步骤，AMPK信号通路是葡萄糖等能量物质代谢的重要调节机制[2021]。本研究结果揭示了人参皂苷Rb1对骨骼肌细胞的葡萄糖消耗利用的促进作用，这种作用可能与AMPKα，SIRT1，PGC1α多个因子的调节密切相关。然而有鉴于经由AMPK信号通路调节的葡萄糖利用多是通过线粒体呼吸链有氧呼吸完成的，人参皂苷Rb1促进葡萄糖消耗及对AMPK信号通路的调节是否与影响骨骼肌线粒体呼吸功能有关，尚待进一步研究明确。

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（2018-10-12收稿責任编辑：王明）