小桐子Dof基因家族生物信息学与表达分析

唐跃辉 包欣欣 王健 冯荆城 张梦 张慧聪 刘梦兰 王玉瑾 娄慧敏 闫浩 谭结 王清伟 刘坤

土壤干旱、盐碱已成为制约中国农作物生长发育的瓶颈，直接关系到中国的国家安全和国民经济可持续发展，解决这一问题的重要途径就是大力加强耐逆性相关基因的挖掘及在分子育种中的开发利用研究。其中，分子育种以其年限短、效率高和目的性强等特点受到作物育种学家的高度青睐，是未来作物育种的主要手段。小桐子，又名小油桐、麻疯树（Jatropha curca$L.），是大戟科麻疯树属的多年生落叶灌木/小乔木，具有耐土壤瘠薄、耐盐特别是耐干旱的特性。因此从具有耐受干旱、贫瘠、盐等特性的小桐子中挖掘耐干旱、耐盐等高效利用的基因资源，并申请基因专利保护，对农作物耐逆品种培育具有重要的农业价值和应用意义。

Dof蛋白是植物特有的一类转录因子，其名称源于靠近N末端的一段由50个氨基酸组成的高度保守的c2c2锌指DNA结构域（命名为Dof结构域），该结构域通过结合下游靶基因启动子区T/AAAAG基序，直接激活这些基因的表达，在植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应中起重要的调控作用。相反，Dof蛋白的c末端是非常多变的，该区域包含蛋白质一蛋白质相互作用域和调控基序，如位于拟南芥AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白c末端的Thr-Met-Asp基序，该基序主要负责AtDOF4.2和AtDOF4.4蛋白的转录激活能力。根据Dof蛋白全长氨基酸序列的相似性和拓扑结构特征，拟南芥Dof基因家族成员被分成9个组，即A、B1、B2、C1、C2.1、C2.C3、D1、D2和D2。近年来，研究者们对植物尤其是拟南芥和番茄的研究結果表明，Dof转录因子对植物的生长发育、初生和次生物质代谢、种子成熟和萌发、抗逆性、植物激素信号转导等有重要的调控作用，如番茄Dof转录因子S1CDFl和S1CDF3通过直接激活胁迫响应基因CORl5、RD29A、RDIO的表达，增加了转基因拟南芥对干旱和盐胁迫的抗性：拟南芥Dof家族基因CDF3是一个正调控因子，过表达CDF3基因推迟了拟南芥的开花时间，增加了拟南芥对干旱和冷胁迫的抗性：ChIP分析显示，AtDOF5.4/OBP4通过直接抑制下游基因CyclinBl;1、CDKBl;1和XTH的表达，负调控细胞周期进程和细胞生长：AtDOF4.2通过直接激活细胞壁松弛因子AtEXPA9的表达.正调控种子表皮的发育。这些研究结果表明，Dof转录因子主要通过调控下游基因的表达，从而影响植物的生长发育进程。目前，随着全基因组学和转录组学测序技术的发展，许多物种Dof转录因子已经被鉴定和全基因组分析，如拟南芥、水稻、大白菜、辣椒、番茄等。值得注意的是，关于Dof蛋白的克隆和功能研究主要集中在拟南芥、番茄、水稻等模式植物中，然而，在大戟科物种中尤其在小桐子中鲜有报道。

目前，对大戟科物种Dof家族基因的组织特异性及非生物胁迫条件下的表达模式和功能的研究尚未见报道，因此，进行小桐子Dof转录因子家族成员的鉴定、表达模式和全基因组详细分析尤为必要，且亟需进行。基于小桐子全基因组测序和不同条件下的表达谱分析结果，筛选并鉴定出小桐子Dof基因家族成员，利用生物信息学和转录组学技术，全面分析了小桐子Dof家族成员的保守域、系统发育树、保守基序、染色体定位，组织特异性表达及非生物胁迫条件下表达模式。该研究结果为进一步研究Dof基因在小桐子生长发育和非生物胁迫响应中的潜在功能提供良好的理论基础和依据。

1材料和方法

1.1植物材料与胁迫处理

小桐子种子来源于中国贵州省，并种植于中国广东省广州市中国科学院华南植物园实验基地。小桐子干旱、盐胁迫处理方法参考Tang等进行，胁迫处理后，选取根进行转录组测序及qRT-PCR分析，并选取正常生长条件下的根、茎、叶和授粉后14 d和35 d的种子用于组织特异性表达分析，锡箔纸包裹后立即放入-80℃超低温冰箱保存待用。

1.2 RNA提取

采用美基生物（Magen，http：//www.magentec.com.cn/）植物RNA提取试剂盒（货号R4152-02）进行小桐子各组织RNA提取，具体的操作方法参考试剂盒说明书中难提抽植物组织总RNA小量抽提进行。采用TaKaRa公司（http：//www.takarabiomed.com.cn/）逆转录试剂盒（货号6210A）进行第一链cDNA合成，具体操作方法参考试剂盒说明书进行。

3讨论

Dof转录因子家族基因在植物的生长、发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。目前，关于Dof基因克隆及功能的研究主要集中在模式植物中，如拟南芥、番茄等，然而，在非模式植物如小桐子中罕见报道。本研究基于转录组测序数据，首次对小桐子Dof基因的组织特异性和非生物胁迫条件下的表达模式进行了全面详细的分析，总共24个小桐子Dof蛋白被鉴定。与拟南芥（36个Dof蛋白）和水稻（30个Dof蛋白）相比，小桐子包含更少的Dof蛋白，一个可能的解释是小桐子Dof家族基因没有经历大规模的全基因组倍增事件，然而大规模倍增事件导致拟南芥和水稻Dof家族基因的扩大。

大量的研究结果表明，系统发育树能够为不同植物同源基因功能的预测提供一些有价值的信息和依据，如拟南芥、小桐子和水稻ERF或WRKY基因家族系统发育树分析结果表明，位于相同亚组的同源基因在保守基序、表达模式和功能等方面是相对保守的;小桐子JcERF034（JcDREB）和它在拟南芥中的同源基因RAP2.4（ATlG78080）属于A6亚组，JcERF034和RAP2.4都受干旱胁迫诱导表达，并且在拟南芥中过表达JcERF034或者RAP2.4均增加了转基因植物对非生物胁迫的抗性[28-29]。因此，我们构建了小桐子、拟南芥和水稻Dof蛋白的系统发育树，该结果不仅可以表明拟南芥、小桐子和水稻Dof家族蛋白之间的演化关系，而且基于已经鉴定的拟南芥Dof基因的功能，还可以为小桐子中同源Dof基因功能的预测提供依据。AtDOF5.4/OBP4（AT5G60850）和小桐子JcDof11位于A组的同一个分支，AtDOF5.4/OBP4负调控拟南芥细胞周期进程和细胞生长，这些结果表明，JcDofll基因也许参与小桐子细胞周期进程和细胞生长的调控。ATDOF5.8（AT5G66940）、JcDof8和JcDof17都属于D2组的成员且位于系统发育树同一分支，ATDOF5.8和JcDof8均响应干旱、盐胁迫反应且过表达ATDOF5.8增加了转基因拟南芥对非生物胁迫的抗性，JcDofl7受干旱胁迫诱导表达，这些分析结果表明，JcDof8和JcDofl7也许在小桐子响应非生物胁迫反应中起重要的调控作用。总之，系统发育树能够提供一些重要的信息，为小桐子Dof基因功能的研究提供有价值的依据。值得注意的是，E组在系统发育树上形成了一个独立的分支，且该组包含8个水稻Dof蛋白和1个小桐子Dof蛋白，不包含拟南芥Dof蛋白。该结果表明，E组的Dof蛋白也许是在水稻、拟南芥、小桐子共同祖先的进化过程中，在水稻和小桐子中保存了下来或者是在拟南芥中丢失。

近几年，越来越多的转录因子家族全基因组的研究结果表明，蛋白序列所含有的保守基序或者功能域在相同的组中是高度保守的，如ERF、WRKY等转录因子家族。然而这些保守基序和系统发育树一样，也能够为研究未知基因的功能提供一些有价值的信息。在本研究中，大多数在同一组中的小桐子Dof蛋白拥有相似的保守基序。这些结果表明，包含相似保守域的这些Dof蛋白也许在小桐子生长发育中拥有相似的功能，值得我们进一步研究和开发利用。

通常，基因的表达模式往往可以为该基因功能的预测提供一些重要的信息。基于小桐子表达谱数据，我们分析了小桐子Dof基因在根、茎皮层、叶和种子不同发育时期的表达模式。JcDof4在根中表达量最高，其表达模式和它在拟南芥中的同源基因CDF4（AT2G34140）的表达模式是相似的，异位表达CDF4导致根小柱细胞（Columella cells）提前分化，因此，我们推测JcDof4可能参与小桐子根生长与发育的调控。JcDofl3在小桐子种子发育后期表达最高，并且它的同源基因AT3G47500在种子成熟期上调表达，因此我们推测JcDofl3在小桐子种子成熟期可能起重要的调控作用。JcDof7在茎皮层有高的表达，它的同源基因ATlG28310目前还没有相关的研究报道，说明JcDof7或者ATlG28310也许在植物茎发育与形成中起重要的作用，具体功能还需要进一步验证。JcDofl4在种子不同发育时期的表达量随着种子的成熟逐漸增加，且该基因在根、茎皮层和叶中几乎检测不到表达，该结果表明JcDofl4基因参与种子不同发育阶段的调控。JcDofl4在拟南芥中的同源基因SCAPl（AT5C，65590）通过调控气孔成熟相关基因的表达，正调控保卫细胞（Guard cell）的分化。前人研究结果表明，Dof基因在植物响应非生物胁迫反应中起重要的调控作用。如在拟南芥中过表达番茄SICDFl基因增加了转基因植物对盐和干旱胁迫的抗性：基于转录组数据分析结果表明，大多数大白菜和辣椒Oof基因被盐和干旱诱导表达。本研究中，12个小桐子boy基因响应盐胁迫反应，10个小桐子Oof基因响应干旱胁迫反应。总之，表达谱分析结果表明，小桐子Oof家族大部分基因在小桐子响应非生物胁迫反应中也许起重要的调控作用，它们的功能还需要进一步通过试验验证。概括起来，尽管Dof转录因子全基因组和表达模式分析不能提供小桐子Oof基因真正的功能，但是小桐子Oof基因表达模式、系统发育树和保守基序分析可以为这些基因在植物生长发育和非生物胁迫响应中的研究提供有价值的理论基础和依据。

本研究中，总共24个小桐子Dof蛋白被鉴定。该研究首次全面详细地分析了小桐子Dof转录因子家族基因在正常生长条件和非生物胁迫条件下的表达模式。小桐子，水稻和拟南芥Dof基因系统发育树和不同条件下的表达模式分析结果为进一步研究Oof基因在小桐子生长发育和非生物胁迫响应中潜在的功能提供有价值的信息，进而促进boy基因在小桐子抗逆分子育种中的应用。