UPLC-MS/MS法测定不同产地何首乌中6种水溶性维生素含量

周利 郭兰萍 高峰 李佳兴 余意 马方励 杨健

摘要 目的：建立超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱联用技术（UPLC-MS/MS）测定何首乌中水溶性维生素类成分的分析方法。方法：将粉碎后的何首乌样品用超纯水超声提取后，经ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）分离并在动态多反应监测模式（MRM）下检测，得到相应的提取离子流图，以峰面积进行定量。结果：何首乌中6个水溶性维生素的含量差别较大，其中VB4为何首乌中维生素的主要来源，在6个维生素类化合物中的含量最高，达到85.89 μg/g;VB6平均含量最低，仅为0.68 μg/g。其余4种维生素類成分VB2、VB5、NA和NAM的平均含量均相对较低。结论：该法简单快速，结果准确、可靠，重复性好，为何首乌中水溶性维生素类成分的深入研究以及何首乌保健产品的开发提供了参考依据。

关键词 何首乌;水溶性维生素;超高效液相-串联三重四极杆质谱联用;含量分析

Determination of 6 Water-Soluble Vitamins in Polygoni Multiflori Radix from Different Habitants by UPLC-MS/MS

Zhou Li1，Guo Lanping1，Gao Feng2，Li Jiaxing1，Yu Yi3，Ma Fangli3，Yang Jian1

Abstract Objective：To establish an Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Mass/Mass Spectrometry（UPLC-MS/MS）method to determine the contents of water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix from different habitants.Methods：The pulverized Polygoni Multiflori Radix sample was ultrasonically extracted with ultrapure water，separated by an ACQUITY UPLC BEH C18 column（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）and detected under dynamic multiple reaction monitoring mode（MRM）to obtain the corresponding extracted ions Flow chart，and quantified by peak area.Results：The contents of 6 water-soluble vitamins in Polygoni Multiflori Radix had great differences.Among them，the content of VB4 was the highest which was 85.89 μg/g; and the content of VB6 was the lowest which was only 0.68 μg/g.The average content of the other 4 vitamins，VB2，VB5，NA and NAM，was relatively low.Conclusion：The method is simple，accurate and reproducible.It provides a reference for the follow-up research of water-soluble vatamins and health food development of Polygoni Multiflori Radix.

Key Words Polygoni multiflora Radix; Water-soluble vitamins; UPLC-MS/MS; Content analysis

中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.008

何首乌为蓼科植物何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，味苦、甘、涩，性微温，归肝、心和肾经[1]，是一种常用补益中药，最早载于《日华子本草》，曰：“其药本草无名，因何首乌见藤夜交，便即采食有功，因以采人为名耳”[2]。何首乌另有地精、仙药、首乌等别名，生用可解毒、消痈、润肠通便，制用能补肝肾、强筋骨、益精血、乌须发，历来被古今医家、食疗养生家所推崇，在医疗、保健、化工等领域占有重要地位[3-4]。目前何首乌生品及炮制品均已纳入我国保健食品原料名录。

维生素又名维他命，是维持人体正常功能不可缺少的营养物质，也是保持机体健康不可缺少的活性物质。研究表明，维生素缺乏将会导致包括皮炎、脱屑、口腔溃疡、坏血病、儿童佝偻病等在内的一系列症状及疾病，同时，维生素对一些疾病也有一定的治疗作用，如研究表明，叶酸、维生素能够降低脑梗死患者血中HCY的水平，降低患者死亡率[5];维生素C可作为电子供体在细胞中产生过氧化氢杀伤肿瘤细胞，在肿瘤治疗中具有广阔前景[6-7]。作为一种重要的功能因子，维生素是各类食品，医疗、保健品原料的重要检测指标;而其在何首乌中的含量却鲜有报道。本研究以超高效液相色谱三重四级杆串联质谱法（UPLC-MS/MS）建立了同时测定何首乌中6种水溶性维生素成分维生素B2（VB2）、维生素B4（VB4）、维生素B5（VB5）、维生素B6（VB6）、烟酸（NA）和烟酰胺（NAM）的方法，并以不同产地来源的15批何首乌样品为研究对象，对其所含的该类成分的含量水平进行了分析及评价，以期为何首乌的深入研究及保健产品开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ACQUITY UPLCTM系统（Waters公司，美国，型号：I-Class），API四级杆-线性离子阱质谱仪（ABSCIEX公司，配有离子喷雾接口，美国，型号：6500），电子天平（梅特勒-托利多有限公司，瑞士，型号：NewClassic MF），超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号SB800DTD），Eppendorf离心机（Eppendorf公司，德国，型号：5810R）。

1.2 试剂 色谱级甲醇和乙腈（Fisher Scientific公司，美国，I1014107923、JB081430）;乙酸铵（LC/MS分析用，Fisher Scientific公司，美国，批号A639-500）;水为自制超纯水，来至赛默飞超纯水系统（电阻率为18.2 M/cm，美国，型号GenPure）。对照品：维生素类化合物对照品共6个，分别为：维生素B2（VB2，批号B21290）、维生素B4（VB4，批号18108459072）、维生素B5（VB5，批号B21291）、维生素B6（VB6，批号B21292）、烟酸（NA，批号BCBH1877V）、烟酰胺（NAM，批号J16N8R47789）。其中维生素B2、烟酸、烟酰胺和维生素B5购买于北京北京融诚鑫德科技发展有限公司;维生素B4和维生素B6购买于上海士峰生物科技有限公司。以上对照品纯度均大于98%。

1.3 分析样品 本研究所用何首乌采自四川、广东、云南等何首乌主产区，经中国中医科学院中药资源中心金艳鉴定为蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥块根，采集具体信息见表1。

2 方法

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）;流动相A：10 mmol/L乙酸铵，流动相B：乙腈，流速：0.5 mL/min;进样量：1 μL，柱温：40 ℃，梯度洗脱：0～1.5 min，流动相A 95%→95%;1.5～4 min，流动相A 95%→45%;4～4.5 min流动相A 45%→95%;4.5～6 min，流动相A 95%→95%。

2.2 质谱条件 离子源：Turbo V;电离模式：ESI+;气帘气（CUR）体积流量：30 L/min，;喷雾电压（IS）：5500 V;雾化气（GS1）体积流量：50 L/min;加热辅助气（GS2）体积流量：50 L/min;采集方式：MRM;离子化温度（TEMP）：550 ℃。优化的条件参数见表2。

2.3 对照品溶液的制备 分别精密称取维生素类标准品适量，制备成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液，其中维生素B2用10%的氨水为溶剂配成单一成分对照品储备液，其他维生素用10 mmol/L乙酸铵：甲醇（9∶1）的溶液为溶剂分别配成单一成分对照品储备液。分别精密吸取各标准储备液适量，分组配制成适量浓度的各混合标准品溶液，其中维生素B2为第1组，维生素B4、维生素B5和烟酸为第2组，维生素B6和烟酰胺为第3组。

2.4 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末50 mg，置于离心管中，精密加入超纯水1.5 mL，称定重量，超声提取30 min（功率：250 W，频率：40 kHz），再称定重量，用超纯水补足减少的质量，12 000 r/min离心10 min，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。放置于4 ℃冰箱供UPLC-MS/MS分析用。

2.5 线性关系考察

取上述3组混合对照品溶液，逐级稀释为7个不同质量浓度的标曲混标溶液，采用2.2和2.3项下条件进行测定，以色谱峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（μg/mL）为横坐标得到回归方程、线性范围与相关系数，结果见表3。结果表明，6种目标成分在各自的浓度范围内线性良好。

2.6 中间精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液，连续重复进样6次，测得各目标化合物峰面积的RSD范围为0.54%～2.67%，证明仪器精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性实验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、3、6 h进样，以测定化合物稳定性。结果显示，各维生素类化合物在6 h内测定值的RSD在2.32%～3.87%之间，证明化合物稳定性良好，满足分析需要。

2.8 重复性实验 取同一份何首乌样品，精密称定6份，按本研究所述提取方法提取完成并过滤测定。结果显示，各目标化合物测定值的RSD在1.78%～4.37%之间，证明方法重复性良好。

2.9 回收率试验 精密称取何首乌样品5份，向其中加入一定质量浓度的对照品溶液。按照2.4项方法处理后进样分析，以计算所得的实际值与加入量的比值即为回收率。6个维生素的平均加样回收率：维生素B2为95.3%，维生素B4为102.9%，维生素B5为96.2%，烟酸为104.3%，烟酰胺为95.8%，维生素B6为105.6%，其RSD均小于6.0%。

2.11 样品的测定结果 取各产地何首乌供试品溶液，按照优化后的色谱及质谱条件进行测定，测定结果根据标准曲线回归方程及实际称样量进行计算，进而得到样品中各化合物的含量。见表4。

3 讨论

不同产地何首乌维生素的总含量在52.97～186.50 μg/g之间，平均含量为108.13 μg/g。其中VB4为何首乌中维生素的主要来源，在6个水溶性维生素中的含量最高，平均值达到85.89 μg/g;VB6平均含量最低，仅为0.68 μg/g。其余4种维生素类化合物在何首乌中的含量均分布在0～10 μg/g之间，VB2、NAM、VB5和NA的平均含量依此为8.41 μg/g、6.67 μg/g、3.25 μg/g和3.23 μg/g。

不同产地来源的样品中，以广西玉林何首乌中维生素总量最高，达到186.50 μg/g，其次是广东高州产何首乌，其维生素总含量为177.79 μg/g;此外，分别来自四川达州、四川宜宾、四川遂宁和贵州凯里的样品中维生素类成分总含量均达到100 μg/g以上，分别为157.62 μg/g、122.29 μg/g和127.29 μg/g。其余产地药材中维生素总量均低于100 μg/g，最低的为安徽亳州产样品，仅为52.97 μg/g，为广西玉林何首乌总维生素含量的28.40%。

本研究还同时检测了何首乌中的VB1、VC、VB7和VB8 4种成分，但此4种成分在何首乌药材中均未检出。研究利用UPLC-MS/MS法测定了不同产地何首乌药材中6种水溶性维生素成分的含量。该法简单快速，结果准确、可靠，重复性好，为何首乌后续的相关研究提供了参考依据。

参考文献

[1]Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People′s Republic of China[S].2015 ed.Part 1.Beijing：China Medical Science and Technology Press，2015.

[2]Jian C.Functional Components and Health Function of Polygonum Multiflorum Thunb[J].Academic Periodical of Farm Products Processing，2009，5（4）：41-42，45.

[3]Cui H R，Bai Z F，Song H B，et al.Investigation of potential toxic factors for fleece-flower root：from perspective of processing methods evolution[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2016，41（2）：333-339.

[4]CAI W J，WU Z H.The efficacy and clinical application of radix polygoni multiflora[J].Clinical Journal of Chinese Medicine，2016（3）：139-140.

[5]ZHOU N Q，HUANG J Y.The Relationship between Homocysteine Level and Severity of Cerebral Infarction and the Effect of Folic Acid and B Vitamins[J].For all Health，2013，11（15）：108-109.

[6]Jing X J，Ji-Hui D U，Ke-Jian H E.Research Progress on Role of Vitamin C in Tumor Therapy[J].Medical Recapitulate，2010，16（4）：554-557.

[7]Zhang L，Zhang T，Tan N，et al.Combined Application of Vitamin C and Arsenic Trioxide in Inhibiting Bladder Cancer Cell Lines T-24 in vitro[J].Cancer Research on Prevention & Treatment，2017，44（2）：103-107.

（2019-10-15收稿 責任编辑：王明）

基金项目：财政部中央本级专项（2060302）;国家自然科学基金青年基金项目（81603241）;国家重点研发计划项目（2017YFC1700701）作者简介：周利（1992.10—），女，硕士，研究实习员，研究方向：中药材质量分析与评价，E-mail：zhouli3131@163.com通信作者：杨健（1981.07—），男，博士，副研究员，研究方向：中药资源，E-mail：yangchem2012@163.com