从代谢组学角度探讨双重腹水超滤浓缩回输治疗肝肾阴虚型肝硬化腹水的机制

2019-09-10顾欢丛庆伟白长川武春燕朱英

世界中医药 2019年12期

顾欢丛庆伟白长川武春燕朱英

摘要目的：從代谢组学的角度探讨双重腹水超滤浓缩回输治疗肝肾阴虚型肝硬化腹水的机制。方法：选取2015年11月至2017年12月大连医科大学附属第一医院收治的肝硬化腹水患者38例作为研究对象，选取其中17例单纯肝硬化腹水患者，利用液质联用平台获得腹水超滤治疗前后患者的代谢物谱。利用偏最小二乘法-判别分析（Partial Least Square-Discrimination Analysis，PLS-DA）分析，筛选出差异代谢化合物并将其输入MetaboAnalyst获得相关代谢途径。结果：1）腹水回输治疗后，肝肾阴虚型患者中医证候较前改善;ALT、AST、TBIL较前下降（P<0.05），TP、ALB较前明显升高（P<0.01）;Urea、Cre较前明显改善（P<0.01）。2）鉴定出与肝肾阴虚型肝硬化腹水回输治疗密切相关的5种化合物，包括鹅脱氧胆酸、胆酸、顺乌头酸、柠檬酸和棕榈酸，并得出与腹水回输治疗密切相关的3条代谢通路，包括柠檬酸循环、原发性胆汁酸生物合成和脂肪酸生物合成。结论：腹水回输治疗可能通过影响上述3条代谢通路取得有效临床疗效，为肝肾阴虚型肝硬化腹水的治疗提供新思路。

关键词双重腹水超滤浓缩回输;肝肾阴虚;肝硬化腹水;代谢组学;超高效液相色谱-质谱;差异代谢物;代谢通路;机制

Mechanism of Double Ascites with Ultrafiltration and Concentration Technique Treatment of the Liver and Kidney Yin Deficiency Liver Cirrhosis Ascites by Metabolomics

Gu Huan1，Cong Qingwei1，Bai Changchuan2，Wu Chunyan1，Zhu Ying1

（1 Infectious Department，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，and Liver Disease of Integrated Chinese and Western Medicine Department，Institute（College）of Integrative Medicine，Dalian Medical University，Dalian 116011，China; 2 Dalian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116013，China）

Abstract Objective：To study the mechanism of double ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment of the liver and kidney yin deficiency liver cirrhosis ascites by metabolomics.Methods：In this study，38 patients with cirrhosis ascites from the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University during November 2015 to December 2017 were selected.The clinical effects of ascites reinfusion were observed and analyzed.17 patients with simple liver cirrhosis and ascites were selected，and the metabolite spectrum of the patients before and after ascites ultrafiltration treatment was obtained by LC / MS.Partial Least Square-Discrimination Analysis（PLS-DA）was used to screen out differential metabolic compounds and enter them into MetaboAnalyst to obtain relevant metabolic pathways.Results：After treatment，the TCM syndrome of patients with liver and kidney yin deficiency improved.The liver function ALT，AST and TBIL were decreased after treatment（P<0.05），and TP and ALB were increased after treatment（P<0.01）.The renal function urea and creatinine were significantly improved after treatment（P<0.01）.2）There were 5 compounds closely related to the treatment of ascites with liver and kidney yin deficiency by ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment，including Chenodeoxycholic acid，Cholic acid，cis-aconitic acid，Citric acid and Palmitoleic acid.3 metabolic pathways were obtained that closely related to the treatment of ascites by ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment，including citrate cycle（TCA cycle），primary bile acid biosynthesis and fatty acid biosynthesis.Conclusion：The treatment of ascites reinfusion can make effect through the 3 metabolic pathways.It provides a new idea for the treatment of ascites with liver and kidney yin deficiency syndrome.

Key Words Double ascites with ultrafiltration and concentration technique treatment; Liver and kidney yin deficiency; Liver cirrhosis ascites; Metabolomics; Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry; Differential metabolites; Metabolic pathways; Mechanism

中圖分类号：R242;R285.6文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.12.066

肝硬化腹水属于中医学“鼓胀”范畴，鼓胀作为疾病名称首现于《黄帝内经》中[1]。鼓胀多因郁热伤阴，或滥用攻逐法泻水伤及阴液，阴损及阳，阴伤日久可致阳虚，故难治性腹水的病机复杂，临床以肝肾阴虚多见，其中医治疗包括中药汤剂、中成药、中药敷脐和灌肠等[2]，但疗程较长，见效较慢。肝硬化腹水的西医治疗包括病因治疗、限钠饮食及应用利尿药物、避免应用肾毒性药物等[3-5]。对于难治性腹水可采用大量放腹水及补充人血白蛋白医治，以及经颈静脉肝内门体分流术（Transjugular Intrahepatic Portosystem Stent-shunt，TIPS），前者易引起低血容量、肾损伤、后循环功能障碍等并发症，后者易诱发肝性脑病，更加损伤肾功能，使腹水的临床诊治更加凶险难治[6]。双重腹水超滤浓缩回输腹腔术（以下简称腹水回输治疗）能够防止上述问题，在医治顽固性腹水方面具有明显优势，成为临床上经常使用的方式。腹水回输治疗可迅速缓解腹胀等症状，在有效滤出水分及内毒素的同时，充分保留白蛋白等大分子物质[7]。本研究从代谢组学角度，结合肝肾阴虚型肝硬化腹水治疗前后证候积分和临床疗效变化及在小分子化合物水平的变化，从中西医角度了解肝硬化腹水的发病机制，并联合中医及西医理论解释腹水回输治疗的临床疗效及代谢组学特征，为肝硬化腹水的进一步治疗研究提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2015年11月至2017年12月就诊于大连医科大学附属第一医院感染科肝硬化腹水的患者38例作为研究对象。其中男20例，女18例，年龄23～71岁，平均年龄（60.31±10.87）岁，平均病程（7.78±3.45）个月;其中乙肝后肝硬化18例（47.37%），酒精性肝硬化11例（28.94%），丙肝后肝硬化7例（18.42%），原发性胆汁性肝硬化2例（5.27%）。根据有无合并肝衰竭或者肝癌分组：其中单纯肝硬化患者17例（44.75%），肝硬化合并肝衰竭患者15例（39.47%），肝硬化合并肝癌患者6例（15.78%）。本方案经医院伦理委员会审核批准实施（伦理审批号：YJ-KY-FB-2019-14）。

1.2 诊断标准依据中华医学会肝病学分会《肝硬化腹水及相关并发症的诊疗指南》（2017年版），中华中医药学会脾胃病分会《肝硬化腹水中医诊疗专家共识意见》（2017年版），《中医诊断学》第8版，《中药新药临床研究指导原则》，中华中西医结合学会消化系统疾病专业委员会《肝硬化腹水的中西医结合诊疗共识意见》（2011年版）。

1.3 纳入标准 1）与肝硬化腹水诊断标准相符合;2）中医证候符合肝肾阴虚型;3）志愿加入实验研究，可以较好地服从实验规则。

1.4 排除标准 1）上消化道出血患者;2）严重肾功能损害患者;3）弥漫性血管内凝血患者;4）心肺功能严重障碍者。

1.5 脱落与剔除标准 1）患者依从性差，不能遵医嘱配合治疗，影响疗效评定;拒绝复查，资料不完整;2）患者自行退出试验者。

1.6 双重腹水超滤浓缩回输治疗方法患者平卧位，分别取左右髂前上棘与脐连线中外1/3处为穿刺点，左入右出，常规消毒铺单，2%利多卡因4 mL局部浸润麻醉至腹膜，多孔穿刺针于穿刺点刺入腹腔。将输入与输出管路与分子筛连接，治疗前用生理盐水冲洗管路，将多孔穿刺针与腹水超滤机管路相连，建立密闭式腹腔回输系统，开始行腹水回输治疗术。腹水被引出后经过中空纤维滤过器进行1次滤过，主要滤过小分子毒素及近50%水分，水及小分子物质则通过导管排入装废弃废液的袋内，从而形成1次浓缩液，再经过细菌过滤器进行2次滤过，产生含有白蛋白等有利物质的2次浓缩液，回输腹内。治疗过程中每隔30 min测血压、脉搏1次，术后多头腹带加压包扎72 h，每次可滤出液体（5 570±3 250）mL，治疗时间为1.5～3 h。

1.7 试剂与仪器超高效液相色谱质谱联用系统采用Wasters超高效液相色谱（UPLC）-Q Exactive HF MS（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA），离心机（Microfuge 22R，Beckman Coulter公司），涡旋振荡器（Vortex Genius3德国IKA集团），乙腈、甲酸（色谱纯）自美国Fisher公司购置，醋酸铵（分析纯）自美国Sigma-Aldrich公司购置，由MILLI-Q超纯化水制备系统（美国Millipore公司）制备超纯水。

1.8 临床样本收集及处理 1）选择肝硬化腹水患者，经腹水回输治疗前后腹水样本，每份样本容积约50 mL。利用装有干冰的恒温箱运输，最终放置在-80 ℃冰箱留存。2）腹水样品预处理：取150 μL腹水样本冻干，加入400 μL含内标提取液（75%乙腈），上清取300 μL冻干，复溶于80 μL25%乙腈溶液等待LC-MS分析。配制75%乙腈溶液（含同位素内标），内标终浓度为乙酰酰基肉碱-d3 0.12 μg/mL，癸酰肉碱-d3 0.075 μg/mL，棕榈酰肉碱-d3 0.06 μg/mL，溶血磷脂酰胆碱0.6 μg/mL，棕榈酸-d3 0.375 μg/mL，硬脂酸-d3 0.375 μg/mL，胆酸-d4 0.3μg/mL，鹅脱氧胆酸-d40.2 μg/mL，亮氨酸-d3 0.75 μg/mL，苯丙氨酸-d5 3.2 μg/mL，色氨酸-d5 2.7 μg/mL。

1.9 色谱条件

1.9.1 正离子模式使用Waters BEH C8（规格是100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（Waters，Milford，MA）色谱柱，柱温为50 ℃，流速为0.35 mL/min。流动相：A相是0.1%甲酸水溶液，B相是0.1%甲酸乙腈溶液。梯度是10% B，维持1 min，在4 min内线性增至40% B，在12 min内增至100% B并维持5 min，在22.1 min处降回初始梯度，并平衡2.9 min。

1.9.2 负离子模式使用ACQUITY UPLC HSS T3（规格是100 mm×2.1 mm，1.8 μm）（Waters，Milford，MA）色谱柱，柱温为50 ℃，流速为0.35 mL/min。流动相：A相是水添加6.5 mM NH4HCO3;B相是含95%甲醇和6.5 mM NH4HCO3水溶液。梯度是0% B，维持1 min，在2 min内线性增至40%B，在13 min内增至100% B并维持5 min，在22.1 min处降回初始梯度，平衡2.9 min。

1.10 质谱条件正离子模式下质荷比的扫描范围是80～1 200 Da，喷雾电压是3.50 kV;负离子模式下质荷比的扫描范围是70～1 000 Da，质谱的分辨率是30 K。离子源参数：毛细管温度是350 ℃，喷雾电压和毛细管电压：4.5 kV和49 V，离子传输电压：100 V，鞘气和辅助气流速分别是45和8个单位（arbitrary units）。分辨率是12e4。

1.11 观察指标选取接受腹水回输治疗前后患者的肝功能、凝血象、肾功能实验室检测结果以及观察临床证候改善情况。

1.12 疗效判定标准中医证候积分标准参照2002年中华人民共和国药品监督管理局制定的《中药新药临床研究指导原则》及中华中医药学会发布的《中医内科常见病诊疗指南》制定。由于舌象和脉象复杂，无法计算分值，故分别对腹大胀满、青筋暴露、眼干眼涩、面色晦暗、口干燥咽、齿龈出血、五心烦热等7个临床症状的严重程度记分。见表1。

1.13 数据处理液质联用平台采集的原始数据使用SIEVE V2.1软件实行滤噪、重叠峰解析、标准化等处置，输出正、负离子峰表，另存为Excel。将表中数据导入SIMCA-P 11.5软件，在PLS-DA模式下进行分析，结合得分图、载荷图、VIP值及非参数检验，筛选出差异代谢化合物。依据化合物的质荷比，通过HMDB（Human Metabolome Database，人类代谢组数据库），KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组），METLIN等数据库确认差异代谢化合物。将差异代谢物输入MetaboAnalyst，获得相关代谢途径。

1.14 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用配对t检验;计数资料用百分比/率（%）表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效分析

2.1.1 38例患者水超滤浓缩回输治疗前后中医症候总积分比较治疗前患者中医症候总积分（14.00±2.12）分，治疗后为（9.20±1.64）分，治疗前后比较差异有统计学意义（P=0.008，P<0.01）。

2.1.2 38例患者水超滤浓缩回输治疗前后中医各症状积分比较治疗后腹大胀满、青筋暴露、眼干眼涩、口干燥咽、五心烦热积分与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05），均治疗后优于治疗前;而面色晦暗、齿龈出血的症状，治疗前后比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.1.3 38例患者腹水超滤浓缩回输治疗前后肝功能和凝血功能比較治疗后ALT、AST、TBIL下降，与治疗前比较，差异有统计学意义（P<0.05）;治疗后TP、ALB在升高，差异有统计学意义（P<0.01）;治疗后ALP、γ-GT下降，与治疗前比较，差异无统计学意义（P>0.05）;治疗前后PT、APTT比较无明显变化。见表3。

2.1.4 38例患者腹水超滤浓缩回输治疗前后肾功能比较治疗后Cre、Urea下降，与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.01）;治疗后UA下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.2 腹水代谢组学分析

利用代谢组学在小分子水平分析肝硬化腹水患者的发病机制，排除合并肝癌肝衰竭患者的病例，选取17例单纯肝硬化腹水患者进行代谢组学分析。把17例肝硬化腹水患者的腹水代谢组学结果按照治疗前后分为2组，将输出的正、负离子表导入SIMCA-P 11.5软件中，构建PLS-DA模型，得到得分图和载荷图。由于负离子模式下PLS-DA预测能力均较差，正离子模式下PLS-DA预测能力均较理想，故采用正离子模式分析。分析结果如下所示。

2.2.1 PLS-DA模式下得分图图中每一个点代表一个样本，黑点代表治疗前，主要分布在第一象限，红点代表治疗后，主要分布在第三象限，治疗前后样本可以很好的区分，验证了腹水超滤浓缩回输治疗的有效性，说明腹水回输治疗可显著影响肝硬化腹水患者内环境中代谢物的水平。见图1。

2.2.2 PLS-DA模式下载荷图图每一点代表一个代谢化合物。远离中间原点的变量，对模型组建、组间分别预测的可信度更高。图中可见多个远离中心的变量，这些变量作为模型构建中的关键变量，间接说明腹水超滤浓缩回输治疗前后代谢物存在显著变化。见图2。

2.2.3 水超滤浓缩回输治疗前后差异代谢化合物筛选在PLS-DA模型中筛选出VIP值大于1的变量，在HMDB、KEGG、METLIN等数据库中筛选出该变量对应的代谢化合物，鉴定出13个VIP大于1的小分子代谢化合物。包括10-十一碳烯酸、吲哚乳酸、磷酸、龙葵碱、DL-色氨酸、棕榈酸、十六碳烯酸、8，11，14-二十碳三烯酸、十六碳二烯酸、鹅去氧胆酸、顺乌头酸、柠檬酸和胆酸，说明腹水回输治疗肝硬化腹水对上述化合物影响显著。其中与腹水回输治疗肝硬化腹水关系密切的化合物有5种，包括顺乌头酸、柠檬酸、鹅去氧胆酸、胆酸和棕榈酸。见表6。

2.2.4 水超滤浓缩回输治疗前后差异代谢物相关代谢途径分析为了鉴定腹水回输治疗前后可能受影响的代谢途径，我们利用MetaboAnalyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）分析腹水超滤浓缩回输治疗前后显著差异，VIP大于1的代谢物。图3中可示5条代谢通路，包括柠檬酸循环（三羧酸循环）、原发性胆汁酸生物合成、乙醛酸盐代谢、脂肪酸的生物合成、色氨酸代谢。图中颜色越深表示代谢物在代谢途径中所占比例越高，-log（P）值越大代表代谢途径越有意义。柠檬酸循环、原发性胆汁酸生物合成为红色，表明腹水超滤浓缩回输治疗肝硬化腹水前后柠檬酸循环、原发性胆汁酸生物合成中相关代谢物的比例最高。其他代谢通路均为橙色，渐变为黄色，说明腹水超滤浓缩回输治疗前后这些代谢途径中相关代谢物的比例较低。其中腹水回输治疗肝硬化腹水密切相关的通路包括柠檬酸循环（三羧酸循环）、原发性胆汁酸生物合成和脂肪酸生物合成。

3 讨论

腹水是体内水液代谢障碍，聚于腹中而成。疾病日久可伤及肝肾，肝病及脾，脾主运化全身水液，脾伤则运化失[8]，体内水液失于运布，久则及肾，肾主机体气化功能，肾伤则气化不行，水湿不化，因而湿聚为水，加重水液的聚集。本研究结果显示，腹水回输治疗肝肾阴虚型肝硬化腹水后患者中医症候总积分及中医各症候积分均降低，面色晦暗，腹大胀满，目睛干涩，牙龈出血，口燥咽干，五心烦热等症状明显改善，说明腹水回输治疗可能可恢复肝脾肾对水液的运化功能，调节水液疏布紊乱。腹水回输经过细菌过滤器进行2次滤过后，截留白蛋白、补体等有利物质再回输腹腔内，腹水蛋白被重新吸收入血后，减少了蛋白质的丢失，提高了血浆TP、ALB水平，增加了胶体渗透压和有效循环血量，患者肝功能得到明显改善，故可见腹水回输治疗后TP、ALB明显升高，ALT、AST、TBIL较前降低。腹水回输可以滤过肌酐、尿素、尿酸等小分子内毒素，同时随着有效血容量的增加以及腹压的降低使肾血管压迫减轻，从而使肾血流量增多，肾小球滤过增加，患者肾功能得到明显改善，故可见腹水回输治疗后Cre、Urea明显降低。腹水回输治疗在临床上取得较好的疗效，本研究欲从分子生物学方面，进一步探讨腹水回输治疗肝肾阴虚型肝硬化腹水的机制。

肝肾阴虚型肝硬化腹水患者治疗前后顺乌头酸、柠檬酸、鹅去氧胆酸、胆酸和棕榈酸差异显著，说明双重腹水超滤浓缩回输治疗可能通过影响小分子化合物水平参与机体三羧酸循环、原发性胆汁酸生物合成和脂肪酸生物合成，从而达到改善患者临床症候的效果。

顺乌头酸和柠檬酸是三羧酸循环的重要中间产物和调节点[9]。柠檬酸循环，也被称作三羧酸循环，在肝脏中进行，是机体全部能量代谢的关键，循环中相关物质与机体糖类代谢、氨基酸代谢及脂类代谢密切相关[10]。顺乌头酸含量降低可使柠檬酸在顺乌头酸酶作用下直接产生异柠檬酸，加快柠檬酸循环，促进糖类、脂类及蛋白质的生成与代谢。腹水回输治疗后顺乌头酸和柠檬酸含量均显著降低，说明腹水回输治疗可能通过降低顺乌头酸及柠檬酸含量来影响机体的柠檬酸循环，进一步影响机体的能量代谢，从而增加机体的能量供应，为肝肾阴虚型肝硬化腹水患者提供部分能源物质。这可能与腹水回输治疗后患者血清白蛋白水平升高有关。

鹅脱氧胆酸和胆酸属于游离型胆汁酸，参与原发性胆汁酸生物合成。肝硬化患者的肝脏对胆汁酸的摄取和代谢清除功能降低，并且受到侧支循环形成及门静脉高压的影响，可使胆汁酸直接入血，导致血清胆汁酸升高[11-12]，游离性胆汁酸积聚可产生细胞毒性。法尼醇X受体（FXR）是胆汁酸受体，对胆汁酸代谢起到重要调节作用，其与胆汁酸结合后，可抑制胆汁酸合成的限速酶CYP7A1的转录，从而抑制胆汁酸的合成[13]。腹水回输治疗后鹅脱氧胆酸和胆酸含量显著降低，说明腹水回输治疗可能通过激活FXR，影响胆汁酸合成途径，减少胆汁酸生物合成，改善内环境。腹水回输治疗后血清T-BIL降低，可能与治疗后特异性差异代谢化合物鹅脱氧胆酸与胆酸显著降低相关。

棕榈酸，又称软脂酸，是一种饱和高级脂肪酸，作为一种游离脂肪酸广泛存在于人体器官和组织。有研究发现适量的棕榈酸具有一定的抗氧化应激作用，棕榈酸合成代谢可刺激细胞产生炎性反应因子，进而诱导核转录因子Nrf2和血红素加氧酶（HO-1）的表达，Nrf2是細胞抗氧化应激反应的关键因子，可通过转录激活下游靶基因HO-1，通过抗氧化应激反应来维持细胞内环境的稳态，进而起到保护机体的作用[14]。腹水回输治疗后棕榈酸显著增加，说明腹水回输治疗可能通过影响脂肪酸生物合成途径，增加棕榈酸合成，提高机体抗氧化应激能力，从而起到保护作用。

中医证型与现代医学中小分子生物学理论有着明显的相关性，中医证型的分子生物学机制研究可以作为中西医结合的契合点[15]。可通过代谢组学特征，结合中医理论和西医机制很好的解释腹水回输治疗后临床疗效改善的机制。为研究腹水回输治疗肝肾阴虚型肝硬化腹水的机制研究提供新思路。

4 致谢

感谢全国名老中医白长川老先生在本研究“中医证候代谢组学”的选题思路给予的启发和指导，以及在本文总结审阅中提出的重要修改意见。

参考文献

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