慢性不可预见性温和性应激对大鼠心肌损伤的影响

成文丈 薛慧英 孔繁晔 刘丽娜 于静 孙梦晗

【摘要】目的：采用慢性温和性不可预见性应激建立大鼠抑郁模型观察心肌组织中一氧化氮、一氧化氦合酶、C-反应蛋白含量的变化，探讨抑郁对心肌损伤的影响。方法：对SD大鼠成年期施予慢性温和性应激42天，建立抑郁模型，通过糖水偏好实验、体重变化记录行为学指标;应用qRT-PCR方法检测心肌组织中NOS、CPR mRNA含量，用Elisa方法检测NO蛋白含量，进一步探讨抑郁对心肌损伤的影响。结果：应激组的体重增加量明显低于对照组（p<0.05）;两组间大鼠的饮糖水量及糖水偏好指数具有明显差异（p<0.001）;雄性的体重增加量及糖水消耗量高于雌性（p<0.05）。应激组的5-HTl A的含量低于对照组，应激组的NOS、CRP、NO的含量高于对照组，且具有统计学意义，P值均<0.05。结论：慢性温和性不可预见性应激诱导NO、NOS、CRP的表达增加心肌损伤的风险。

【关键词】慢性温和性不可预见性应激，一氧化氦，一氧化氦合酶，C-反应蛋白

[中图分类号]R541 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2019）17-0010-02

抑郁症作为冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronaryAtheroselerotic Heart Disease，CHD）的独立危险因素，不但增加CHD的发病率，而且对CHD的预后产生不良影响，严重抑郁可使脂质过氧化增加，血浆HNE和ADMA（4甲基-2-NONERAL和不对称的二甲基精氨酸）水平显著升高，血浆NO明显减少，内皮NOS产生减少，从而影响了血管收缩和神经递质的释放，影响了血流灌注，加重内皮损伤，最终增加了冠心病风险。但国内研究者通过动物抑郁模型发现心肌中NO、NOS的表达含量的增加，引起心肌的损伤。二者之间的差异性分析需在本实验研究中进一步的验证。

1材料与方法

1.1实验材料成年SD大鼠40只，购置，体质量180～220克，雄性、雌性各20只，饲养条件：（23±2）℃，湿度50%±10%，自然光照（12 h/12 h），自由摄食饮水，雄鼠雌鼠分开饲养。适应环境一周后，随机分为实验组和控制组，每组各10只。大鼠、鼠粮、垫料均由辽宁省长生生物技术股份有限公司提供。本实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

1.2实验方法

1.2.1慢性不可预见性温和性应激（Chronic unpredictabilityofmild stress，CUMS）

具体的应激方法包括：45°鼠笼倾斜，悬尾3min，湿笼，剥夺饮水或饲料，昼夜光照颠倒等。为避免动物适应应激，干扰应激效果，所有的应激方法均为随机选定。期间，每周日上午10：00监测小鼠体重变化。4周应激结束后对小鼠进行糖水偏好实验。造模结束后，先进行行为学测试，测试完成后麻醉大鼠，取各组大鼠心肌和海马组织，备用。

1.2.2糖水偏好实验评价大鼠快感缺失状态实验前先对大鼠进行糖水预适应，将1%蔗糖水及清水置于大鼠籠上，使其适应糖水味道。实验前大鼠禁食禁水24h。实验时将大鼠单独置于干净的笼内，笼中放置事先称质量的糖水瓶及清水瓶各1瓶，0.5 h后交换两瓶的位置，1 h后取走糖水瓶及清水瓶称重，计算每只大鼠的糖水偏好情况，糖水偏好值=糖水饮用量/总液体饮用量×100%。

1.2.3用Qrt-pcr法检测海马内5-HTlA、心肌内NOS、CRP的mRNA含量先采用Trziol法提取Rna，使用HiScriⅡQSelect RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）进行反转录，后用试剂ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行实时荧光定量PCR反应。记录循环阈值（cycle threshold，ct），通过△△Ct法来计算各个处理组相对于对照组的循环阈值倍数，从而衡量各组间mRNA表达的差异。引物设计如表1。（试剂及引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供）

1.2.4检测NO蛋白含量采用酶联免疫吸附试验法测定NO含量，所有步骤按说明书操作。测试完成后分别根据标准曲线，计算出各组大鼠心肌组织中NO蛋白含量并进行统计分析。（试剂由海联生物提供）

1.2.5统计方法统计学分析使用SPSS 19.0软件对数据进行统计，计量数据均以平均数±标准差（x±s）表示。组间差异比较采用独立样本t检验。

2结果

2.1大鼠行为指标变化CUMS结束后的体重与大鼠的最初体重的增加量方面，应激组明显低于对照组（p<0.05）。CUMS结束后检测大鼠的饮糖水量及糖水偏好指数具有明显差异。应激组的糖水消耗量和偏好值明显低于对照组。雄性的体重增加量及糖水消耗量高于雌性，但糖水偏好值低于雌性。详见表2和表3。

2.2大鼠的心肌损伤指标及5-HT表达含量的变化应激组的5-HTlA的含量低于对照组，应激组的NOS、CRP、NO的含量高于对照组，且具有统计学意义。见表4。

3讨论

慢性不可预见性温和应激是建立抑郁动物模型较理想的方法之一，能使大鼠出现典型的抑郁症临床症状，如：兴趣丧失、反应迟钝、情绪低落、记忆力减退、体重减轻等。研究中应激组的体重增加量明显低于对照组，表明CUMS能诱导大鼠体重减轻。糖水偏好实验可用于评估模型动物的快感缺失状态，是衡量陕感缺乏的客观指标。本研究结果与吴红芳的研究结果一致，应激组与对照组比较具有明显差异。研究表明，大鼠成年期遭受CUMS会出现抑郁症状，快感缺失。

下丘脑一垂体一肾上腺轴失调导致抑郁的发生。当机体受到应激时，HPA轴调控释放促肾上腺皮质激素释放激素，导致5-羟色胺及去甲肾上腺素合成不足，出现与抑郁症相关的症状。抑郁模型的大鼠海马区的代谢指标亦会出现异常并呈一定规律性动态变化。研究中海马的5-HT的减少与抑郁症的发病机制有关。一氧化氮浓度增加，可能通过影响中枢5-HT、NE等神经递质释放并加重脑损伤而诱发抑郁症状。目前，在心血管方面有学者研究认为持续产生合适浓度的NO有利于心肌的保护。但本研究中心肌组织的NO、NOS含量高于对照组。可能由于NOS在生理状态下不表达，但可因内毒素和某些细胞因子等激活，通过调控产生大量NO，释放持续时间长达数小时至数日，超出机体代偿范围而表现出毒性作用，促进细胞凋亡的发生。这提示人体内NO的平衡具有十分重要的作用，一方面，持续产生适合范围浓度的NO有利于保护心肌;另一方面，失衡会使NO成为心血管的损伤因素，高浓度的NO可能有促凋亡的作用。已有动物实验证实上调心肌中NOS含量后心肌细胞凋亡增多，而给予NOS抑制剂治疗后，心肌细胞凋亡数量减少。

C-反应蛋白与冠心病的发生、发展、危险度分层以及预后密切相关，因此CRP作为冠心病的影响因子之一，被认为是预测未来心血管危险的重要炎症标记物，CRP还能抑制血管肉皮细胞分泌NO、介导血管平滑肌凋亡。提示慢性炎症反应可能是抑郁促发、加重冠心病的一个重要的病理生理机制。精神应激或抑郁可能通过改变机体神经内分泌及免疫系统，从而触发或加重了内皮的损伤以及随后发生的炎症过程，进而诱发、促使冠心病的产生。CUMS可以通过刺激炎因子的释放而形成炎症，导致冠状动脉病变。表明炎症因子可能作为冠心病的一个预测因子，心理应激也能够增加冠心病的风险。

综上所述，慢性温和性应激能够诱导大鼠心肌损伤，关于心肌损伤的机制仍需进一步研究。但同时表明，心血管疾病患者应在关注原发疾病时亦应关注患者的心理健康，紧靠“双心”医学理念，为心血管疾病提供新的治疗策略。