锌螯合法提纯石莼多酚工艺优化及其体外抗氧化活性评价

陈雨晴 吕峰 王金铭

摘要：[目的]优化锌螯合法提纯石莼多酚工艺，评价提纯前后样品的抗氧化活性。[方法]以石莼多酚锌螯合率为指标，单因素试验初步探讨锌盐种类、氯化锌质量浓度、石莼乙醇粗提物质量浓度、乙醇体积分数、反应时间、pH等6个因素对石莼多酚螯合锌的影响，并通过响应面法优化其关键工艺参数;以石莼多酚锌螯合物解离率为指标，确定解离剂EDTA质量浓度;比较分析提纯前后样品对ABTS·、DPPH·、·OH的清除能力。[结果]以83%乙醇溶液为溶剂，配制质量浓度为6.8mg·mL的石莼乙醇粗提物样液，控制氯化锌质量浓度15.0mg·mL，pH8.0为优化提纯条件;此外，控制螯合反应时间30min，解离剂EDTA质量浓度20mg·mL，提纯后样品中的石莼多酚含量由粗提物的6.95%增至25.18%，纯度提高了2.62倍。石莼乙醇粗提物与提纯物均具有良好的体外抗氧化活性，对3种自由基的清除能力顺序为·OH>DPPH·>ABTS·。相比粗提物，提纯物对ABTS·、DPPH·、·OH的清除能力分别提高了5.12、8.35、11.70倍，且当质量浓度分别达到16、12、8mg·mL后，对应的清除能力与Vc无显著性差异。[结论]经过工艺优化的锌螯合法可以显著提高石莼乙醇粗提物中的多酚含量及其体外抗氧化活性，为石莼多酚的深层次开发应用提供参考依据。

关键词：锌螯合法;石莼多酚;响应面法;抗氧化活性

中图分类号：TS254.9文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2019）12-1447-10

0 引言

[研究意义]石莼Ulva lactuca隶属于绿藻门，多生长于水质肥沃的海湾，全年均有生长;主要分布于西太平洋沿海地区如日本、中国、朝鲜等，是我国黄海、渤海产量最多的大型经济绿藻，资源极为丰富。相关研究表明，石莼中含有多酚类物质，其因独特的化学结构具有抗氧化、抑菌等生物活性，在食品及医药行业极具开发前景，因而寻找高效、便捷的多酚提取纯化方法也成为藻类功能成分研究的热点之一。[前人研究进展]目前，常用多酚纯化方法包括大孔树脂吸附法、膜分离法、高效液相色谱法等，这些方法普遍存在成本高、生产周期长、难以实现产业化等缺点。金属螯合法是利用多酚分子中的多个邻位酚羟基结构作为配体与金属离子发生配位反应，降低多酚的水溶性而形成螯合物沉淀，实现多酚与非酚类物质的分离;再通过解离剂溶解沉淀物，使多酚游离出来而实现纯化。该方法具有周期短、成本低、易操作等优势，虽然所得产品的纯度有一定局限性，但容易实现工业化生产，仍具有潜在的应用价值。[本研究切入点]关于锌螯合法提纯石莼多酚工艺优化及其抗氧化活性评价目前尚未见报道。[拟解决的关键问题]本研究以石莼乙醇粗提物为试材与参照物，采用锌螯合法提纯其中的石莼多酚，通过响应面法优化石莼多酚提纯工艺;并对提纯前后样品的体外抗氧化活性进行评价，以期为海藻多酚的深层次开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1材料与设备

石莼粉：80目，购于福建海兴保健食品有限公司;

乙醇溶液、碳酸钠、柠檬酸、氯化锌、乙酸锌、硫酸锌、乙二胺四乙酸（EDTA）：均为食品级;没食子酸、福林酚试剂：均为分析纯;

SK8210LHC超声波清洗器：上海沪粤明科学仪器有限公司;RE52-99旋转蒸发器：河北云端化工仪器设备有限公司;DL-5-B型低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂;SepectraMax i3X酶标仪：美谷分子仪器有限公司;FreeZone 6L落地式冻干机：美国LABCONCO公司;79-1型磁力搅拌器：金坛市国旺实验仪器厂;PT-20便捷式pH计：河南中良科学仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1石莼乙醇粗提物制备 准确称取一定量石莼粉末，60%乙醇溶液为溶剂，以料液比1：20，超声波功率400w，提取时间100mm，提取温度45℃为条件，制备石莼乙醇浸提液，并将其浓缩至原体积5%左右，按1：5比例加无水乙醇静置过夜，除去蛋白质与多糖，将上清液真空浓缩后冷冻干燥即为石莼乙醇粗提物（多酚含量为6.95%）。

1.2.2锌螯合法提纯石莼多酚制备工艺优化准确称取一定量石莼乙醇粗提物，用一定浓度的乙醇溶液配制成一定质量浓度的石莼乙醇粗提物样液，在搅拌条件下以1：1比例缓慢加入一定浓度的锌盐溶液，用碳酸钠溶液调节反应体系pH，待螯合反应完全后，收集沉淀物，将其分散于乙醇溶液中，加入一定浓度的EDTA进行解离，收集解离液真空浓缩后冷凍干燥，所得物为石莼乙醇提纯物。

在单因素试验中，分别设锌盐质量浓度20.0mg·mL，乙醇体积分数60%，反应时间20min，pH7.0，石莼乙醇粗提物质量浓度10.0mg·mL，EDTA质量浓度10mg·mL，待获得某因素理想水平后，则以其为条件继续后续其他因素试验，考察各因素对石莼多酚纯化效果的影响;选取对石莼多酚锌螯合率具有极显著影响的因素，进一步采用响应面法优化石莼乙醇粗提物中多酚螯合锌的反应条件，各因素与水平见表1。

1.2.3指标与检测方法

（1）多酚含量测定参照Pereira等的方法稍作修改，采用Folin-Ciocalteu法对溶液中的多酚含量进行测定。

（2）石莼多酚锌螯合率测定

式中：C-螯合反应后上清液的石莼多酚浓度（mg·mL）;V-螯合反应后上清液的体积（mL）;C-螯合反应前样液的石莼多酚浓度（mg·mL）;V-螯合反应前样液的体积（mL）。

（3）石莼多酚锌螯合物解离率测定

式中：C-螯合反应前样液的石莼多酚浓度（mg·mL）;C-螯合反应后上清液的石莼多酚浓度（mg·mL）;C-解离反应后滤液的石莼多酚浓度（mg·mL）。

（4）体外抗氧化活性测定

配置质量浓度为2、4、8、12、16、24、32、40mg·mL的石莼乙醇粗提物与提纯物的水溶液，以相同质量浓度的Vc为对照组，分别进行体外抗氧化活性评价。对DPPH·、ABTS+·、·OH等3种自由基清除能力的测定参照文献。

1.3 数据分析

采用Origin Lab 2017软件对试验数据进行作图分析;采用DPS v7.05软件以Duncan新复极差法对各单因素的均值进行差异显著性检验，显著性界值以P<0.01为极显著，P<0.05为显著，P>0.05为不显著;采用Design Expert 8.0.5软件设计响应面试验，并进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 锌螯合法提纯石莼多酚的单因素试验结果

2.1.1 不同锌盐对石莼多酚锌螯合率的影响不同锌盐的阴阳离子之间的作用力有所不同，与多酚的配位能力也有所差异，从而影响其与多酚的螯合能力。图l结果显示，在同样的条件下，3种锌盐均能与石莼乙醇粗提物中的多酚进行螯合反应，其中氯化锌与石莼多酚的螯合能力为47.45%，极显著（P<0.01）强于乙酸锌（42.14%）和硫酸锌（37.33%），故确定氯化锌作为后续提纯石莼多酚试验的锌盐。

2.1.2氯化锌溶液浓度对石莼多酚锌螯合率的影响如图2所示，氯化锌质量浓度为10～20mg·mL，石莼多酚锌螯合率上升至最大值（49.87%）;继续提高氯化锌质量浓度，石莼多酚锌螯合率呈下降趋势后趋于稳定。当锌离子含量过少时，石莼乙醇粗提物中的多酚与锌离子反应不充分，造成螯合率偏低;随着氯化锌质量浓度的增加，锌离子与石莼多酚浓度逐渐达到理想摩尔比，有助于螯合反应的进行;但继续加大氯化锌质量浓度，过多的氯化锌可能导致溶液pH变小，破坏石莼多酚锌螯合物的稳定性，致使螯合率有所下降。因此，确定与石莼乙醇粗提物中多酚进行螯合反应的氯化锌质量浓度为20mg·mL左右较为合适。

2.1.3 乙醇体积分数对石莼多酚锌螯合率的影响图3显示，随着乙醇体积分数的增大，石莼乙醇粗提物中多酚锌螯合率呈极显著（P<0.01）上升趋势，当乙醇体积分数为80%时，石莼多酚锌螯合率达到最高值（51.10%）;若继续提高乙醇体积分数，石莼多酚锌螯合率反而减小。作为反应媒介，乙醇溶液的极性直接影响溶质成分的溶解程度。随乙醇体积分数的增加，乙醇溶液與石莼多酚的极性逐渐接近，有助于酚类物质的溶出，从而促进石莼多酚与锌离子的螯合反应;若乙醇溶液浓度过高，则可能促进粗提物中极性较大物质的溶出，反而干扰了石莼多酚与锌离子的螯合反应。故确定80%乙醇溶液为本研究石莼多酚螯合锌反应的适宜溶剂。

2.1.4反应时间对石莼多酚锌螯合率的影响图4结合统计分析可知，在反应时间为10～30min，样液中石莼多酚锌螯合率随时间的增大而提高至最高值（47.81%）;反应时间超过30min后，石莼多酚锌螯合率无显著（P>0.05）提高。当反应时间不充足时，样液中的石莼多酚与锌离子反应不完全而影响螯合效果;随着时间的延长，螯合反应逐渐完成并达到最高螯合率;若再继续延长时间则影响不大。故从节约时间、成本的角度考虑，控制反应时间为30min左右较为经济适宜。

2.1.5反应体系pH对石莼多酚锌螯合率的影响图5可知，反应体系pH为5.0～8.0，石莼多酚锌螯合率随pH的增大而极显著（P<0.01）提高至最大值（50.15%）;在8.0～10.0，继续增加pH，石莼多酚锌螯合率呈极显著（P<0.01）下降趋势。相关文献表明，反应体系pH是影响多酚类物质与金属离子螯合反应的关键因素。pH的增大会促进酚羟基中H的解离，可有效提高多酚与金属的螯合率;反之，pH过高，多酚易被氧化成醌类物质，锌离子的水解反应占据主体减弱其配位能力，亦影响螯合效果。故本研究确定石莼乙醇粗提物中多酚螯合锌反应体系的理想pH为8.0左右。

2.1.6石莼乙醇粗提物质量浓度对石莼多酚锌螯合率的影响

图6显示，当石莼乙醇粗提物质量浓度为6mg·mL时，锌螯合分离粗提物中多酚的效果最好（57.16%）;继续增大或降低其浓度，石莼多酚锌螯合率均呈极显著（P<0.01）下降趋势。在石莼乙醇粗提物中，除了酚类物质外，还有其他成分，如多糖、蛋白质等也能与锌离子反应生成螯合物，但螯合能力各不相同。低浓度时，粗提物中石莼多酚含量较少，与锌离子的螯合反应不完全;反之，当粗提物质量浓度过高时，虽石莼多酚含量有所提高，但其他成分浓度也随之增加，甚至可能增加的绝对量超过多酚类物质，同石莼多酚竞争与锌离子发生螯合反应的趋势愈加明显，造成石莼多酚锌螯合反应减弱。鉴于此，本研究确定石莼乙醇粗提物质量浓度为6mg.mL-1是石莼多酚螯合锌反应的适宜浓度。

2.2 响应面法优化工艺参数

2.2.1 回归方程的建立与方差分析采用Desi2nExpCd 8.0.5统计分析软件对表2数据进行处理，建立乙醇体积分数（X）、反应体系pH（X）、氯化锌质量浓度（X）和石莼乙醇粗提物质量浓度（X）4个因素与响应值石莼多酚锌螯合率Y的回归方程为：

由表3数据显示，石莼多酚锌螯合率r方程回归模型极显著（P<0.0001），失拟项不显著（P=0.4632>0.05），决定系数R=0.9908，调整决定系数R=0.9816，变异系数CV=1.19%，提示石莼多酚锌螯合率的预测值与试验所得实际值拟合度良好，可用来分析预测石莼多酚锌螯合率。

2.2.2 因素间的交互作用 结合表3分析结果可知，XIX2（乙醇体积分数和反应体系pH）、XX（乙醇体积分数和氯化锌质量浓度）、XX（氯化锌质量浓度和石莼乙醇粗提物质量浓度）的交互作用对石莼多酚锌螯合率r有极显著（P<0.01）影响。

图7（a）显示，当石莼乙醇粗提物质量浓度X<6.53mg·mL与氯化锌质量浓度X<17.65mg·mL时，石莼多酚锌螯合率随二者水平的增加呈极显著（P<0.01）上升趋势;当二者的浓度分别超过此范围后，石莼多酚锌螯合率Y呈下降趋势。由图7（b）可知，乙醇体积分数X<79.45%，氯化锌质量浓度X<20.95mg·mL时，二者的交互作用对石莼多酚锌螯合率Y的影响呈极显著（p<0.01）正相关關系;继续提高二者的浓度，则对石莼多酚锌螯合率Y呈负相关关系。图7（c）显示，与反应体系pHX相比，乙醇体积分数X曲线较为平缓，对石莼多酚锌螯合率Y的影响不明显;在试验范围内，石莼多酚锌螯合率Y随反应体系pH呈极显著（P<0.01）先上升后下降的趋势;当乙醇体积分数为80.10%，反应体系pH为7.97时，石莼多酚锌螯合率r达到最大值。

2.3 工艺条件优化与验证试验

使用Design Expert 8.0.5对回归方程进行求解，得出锌螯合法提纯石莼多酚的最佳工艺条件组合为：乙醇体积分数82.58%，反应体系pH 7.96，氯化锌质量浓度15.05mg·mL，石莼乙醇粗提物质量浓度6.77mg·mL，同时控制反应时间30min，所得石莼多酚锌螯合率的预测值为62.24%;为提高实际操作的便利性，将上述优化组合条件修正为：乙醇体积分数83%，反应体系pH 8.0，氯化锌质量浓度15.0mg·mL，石莼乙醇粗提物质量浓度6.8mg·mL，并以此为条件，进行扩大性验证试验，平行重复三次，所得样品的石莼多酚锌螯合率平均值为61.52%，与理论预测值（62.24%）相对误差为0.72%，无显著性差异（P>0.05），说明预测值与实际值拟合性较好，响应面得到的工艺参数准确可靠，在实际生产中可行。

2.4 EDTA用量对石莼多酚锌螯合物解离效果的影响

EDTA螯合金属的能力强于酚类物质，故可用EDTA解离多酚金属螯合物以提纯多酚类物质。图8显示，在5～20mg·mL浓度范围内，石莼多酚锌螯合物的解离率与EDTA质量浓度呈极显著（P<0.01）正相关关系，解离率由33.98%增加至最大值85.82%;继续提高EDTA质量浓度，解离率则有所下降。当EDTA质量浓度过高时，亦可解离反应体系中非酚物质与锌的螯合物而影响最终样品纯度，且过量的EDTA会带来一定的安全隐患。故从解离效果与安全角度考虑，本研究确定EDTA质量浓度为20mg·mL左右较为适宜。

综上，采用优化的锌螯合工艺条件制备石莼多酚锌螯合物，再经EDTA解离后，样品的石莼多酚含量从粗提物中的6.95%增至25.18%，纯度提高了2.62倍，说明锌螯合法提纯石莼多酚的效果良好。

2.5体外抗氧化活性的测定

图9显示，在试验浓度范围内，石莼乙醇粗提物样液对AB子S·、DPPH·、·OH的清除能力呈极显著（P<0.01）的剂量效应，当其质量浓度为40mg·mL时，对3种自由基的清除率均达到最大值（依次为74.94%、79.12%、81.93%）;随着质量浓度的增加，石莼乙醇提纯物样液在16、12、8mg·mL时，对ABTS·、DPPH·、·OH的清除率分别极显著（P<0.01）上升至94.89%、92.33%、94.86%，继续提高质量浓度，清除率均趋于稳定，且与对照组Vc无显著（P>0.05）差异。石莼乙醇粗提物与提纯物对ABTS.清除能力的IC分别为3.83、19.64mg·mL，对DPPH·清除能力的IC分别为2.22、18.54mg·mL，对·OH清除能力的IC分别为1.35、15.80mg·mL，即相同条件下提纯物对ABTS·、DPPH·、·OH清除能力分别是粗提物的5.12、8.35、11.70倍。

海藻多酚的抗氧化活性得益于其分子上的酚羟基团，能捕获并清除活性能力极高且瞬间即逝的自由基;能释放H，终止氧化链式反应;能与金属离子螯合，减少金属离子对氧化反应的催化作用。上述研究结果表明，一定质量浓度的石莼乙醇提纯物具有与同质量浓度Vc相当的自由基清除能力;石莼乙醇提纯物的体外抗氧化活性极显著（P<0.01）高于粗提物，揭示样品的体外抗氧化活性与其多酚含量呈正相关关系;通过比较ABTS·、DPPH·、·OH清除能力的IC可知，石莼乙醇粗提物与提纯物对三种自由基的清除能力为·OH>DPPH·>ABTS·。

3讨论与结论

本研究采用响应面法优化获得锌螯合法提纯石莼多酚的关键工艺参数组合为：乙醇溶液浓度83%，石莼乙醇粗提物样液质量浓度6.8mg·mL，氯化锌溶液浓度15.0mg·mL-1，pH 8.0。在该条件下，结合反应时间30min，所得样品的石莼多酚锌螯合率平均值为61.52%，与理论预测值（62.24%）无显著性差异（P>0.05）;在此基础上，添加质量浓度为2.0%的EDTA进行解离，所得石莼乙醇提纯物中的多酚含量为25.18%，相比其粗提物（多酚含量6.95%）多酚纯度提高了2.62倍。体外抗氧化活性評价表明，在本试验浓度范围内，石莼乙醇粗提物与提纯物对3种自由基的清除能力均为：·OH>DPPH·>ABST·;提纯物对ABTS、DPPH·、·OH的清除能力分别是粗提物的5.12、8.35、11.70倍，当质量浓度分别达到16、12、8mg·mL时，提纯物的ABTS·、DPPH·、·OH清除率与V无显著性差异。

金属螯合法是利用石莼多酚分子中的酚羟基团与锌离子发生配位反应，形成多酚-锌螯合物实现多酚与非酚类物质的分离;再通过EDTA解离该螯合物，使多酚游离出来而实现纯化，具有成本低，生产周期短，可实现产业化等优势。相关研究表明抗氧化活性是多酚最为突出而普遍的生物活性，其得益于多酚分子上的酚羟基能释放氢离子，终止氧化链式反应;能捕获并清除活性极高且瞬间即逝的自由基;能螯合金属离子，减少其对氧化反应的促进作用，且抗氧化活性与多酚含量成量-效关系。本试验显示锌螯合法提纯石莼多酚效果良好，其乙醇提纯物相比粗提物具有更强的抗氧化活性。这与前人报道一致，采用金属络合法纯化后的大果沙棘黄酮含量明显提高，黄酮含量由9.1%提高至52.1%;银杏黄酮以乙酸锌为螯合剂，EDTA为解离剂，其在最佳条件下使黄酮纯度提高了2.3倍，抗氧化活性亦显著增强。近几年，金属螯合法多应用于茶、果蔬等陆生植物酚类物质的分离纯化领域，但对海洋藻类的应用尚未见报道。本研究尝试采用锌螯合法分离纯化石莼多酚，但提纯程度不够理想，这可能是海藻中酚类物质含量相较于陆生植物更低，因而不易聚集形成金属离子螯合物基团。今后仍需逐步完善此工艺，以期提高多酚纯度。此外，提纯前后的样品中酚类物质的主要成分是否发生变化目前亦不清楚，因此可在后续试验中通过HCLP来加以检测分析，进一步为海藻多酚深层次开发利用提供理论基础。