水稻品种Lemont抗稻瘟病基因QTL的初步定位

薛文君　宋丽　万四新　李民　李森

摘要：用四川稻瘟病高发区的优势稻瘟病菌生理小种对引进的水稻品种Lemont进行抗谱测试，结果表明，水稻品种Lemont中含有数个控制稻瘟病病斑和病斑数量的抗性QTL基因；通过稻瘟病抗性品种Lemont和易感品种丽江新团黑谷为亲本构建了F2作图群体，利用SSR分子标记构建遗传图谱，Lemont中的两个抗瘟性QTL基因位點定位在水稻第八、十一染色体上，可以利用这些标记快速检测相关抗性基因，通过进一步研究开发出与这两个抗性QTL位点紧密连锁的分子标记，为育种工作更有效地利用抗瘟性基因资源提供便利。

关键词：水稻；品种Lemont；稻瘟病菌；SSR标记；QTL

四川稻区稻瘟病菌生理小种种类多、毒性强、病害发作频率高，发病时造成水稻产量的较大减产，因而抗稻瘟病的水稻品种受到广泛的研究，取得的成果相当丰富，一些成果也在生产上得到了应用，效果明显。四川省农业科学院育种专家连续对新育成的具有良好抗病性的五个水稻品种进行大田诱发稻瘟病实验，表明Lemont和其他四个水稻品种都是持久的抗稻瘟病品种；利用稻瘟病表型鉴定和SSR分子标记多态性检测相结合的方法，在第11和第8染色体上检测到抗性QTL位点，为实验室利用分子标记快速检测水稻中的这些抗性基因和进一步开发出与该位点更近更紧密的连锁分子标记打下基础。

一、材料和方法

（一）实验材料

1、水稻鉴定品种、供试水稻品种与菌株。水稻鉴定品种采用国内标准水稻品种特特普（tetep）、珍龙13、四丰13、东农363、关东51、合江18与丽江新团黑谷中国7个统一的鉴别品种（全国稻瘟病菌联合调查组1979）；供试菌株选用（2015年夏）从四川几个稻瘟病流行稻区分离的120个菌样，供试水稻品种为五个稻瘟病抗性品种和稻瘟病易感品种丽江新团黑谷（LTH），均由四川省农业科学院提供。

2、实验仪器与药品。PCR仪由BIO—RAD公司提供，主要实验仪器、药品及溶液配方参考金冬雁《分子克隆》第二版。

（二）实验方法

实验方法按照四川省农业科学院植物保护研究所提供的方法进行；亲本间的SSR多态性分析、F2单株叶片DNA提取、PCR反应体系参考金冬雁《分子克隆》第二版并做适当修改；SSR Marker信息来自http：∥www.gramene.org网站；遗传分析与作图采用MaDmaker/exp3.0版本和Wincart软件，在水稻第4、6、8、11和12共五条染色体上，分别对控制病斑数目和病叶面积作图，将显示出与抗性带型一致的个体的带型记做A，与易感带型一致的个体的带型记做B，杂合带型记做H，输入到Mapmaker软件中，进行计算与作图分析。

二、结果与分析

（一）稻瘟病菌生理小种的鉴定

在采集的120个菌样中，鉴定出了ZB、ZC、ZG、ZE4个大群，ZB13、ZB21、ZB31、ZB29、ZBl5、ZB32、ZCl5、ZGl、ZEl共9个生理小种。

2014年与2015年相比，ZB小种呈上升趋势。未鉴定出ZA小种，但却出现了ZC小种。在ZB种群中检测出6个小种。强致病力的ZF小种没有检测到。

由此可知，四川水稻产区的优势稻瘟病菌种群为ZB群，其连续出现的频率保持相对稳定，研究人员要重点观测ZC、ZB群小种的动态变化并及时做出预警，适时推广种植对ZC、ZB群具有抗性的优质水稻品种。

（二）抗谱测定

大区R9等六个抗性水稻品种与易感黑谷（LTH）大田测试结果表明：六个品种均表现高抗，黑谷表现为高感，这与农技人员多年的大田观测结果一致（抗性检测见表2、表3）。

（三）亲本组合间SSR多态性分析

用合成的850对SSR标记，在五个组合间进行多态性筛选。它们与丽江新团黑谷的多态性比率分别为：R9为187/850=22%，R10为146/850=17%，3263为191/850=22.4%，448为206/850=24%，Lemont为83/850=9%。由此可知，在育种上选取差异较大的个体作为亲本进行组合，取得的成效相对明显。

1、F2定位群体的构建及表型鉴定结果。选取抗性水稻Lemont和易感黑谷（LTH）组合测试，构建作图群体。

选取B31生理小种接种，共得到917株F2植株。Lemont及正反杂交F1鉴定为抗病，新团黑谷为感病，F2群体中抗病株数：感病株数=2.84：1；差异性检测（p<0.05）表明，实际观测结果与理论计算结果有较大偏差，表明来自抗性亲本lemont中的抗性基因，其遗传模式由数量性状基因决定。

2、引物筛选。找到RM 5766、RM5985共2个共分离标记。用2个共分离标记附近新合成的41对标记在两亲本间寻找多态性，结果在11染色体上找到8个标记，在两亲本间有多态性，在8染色体上找到RM1341、RM27373。

（四）遗传分析与抗稻瘟病QTL的定位

通过表型鉴定和分子数据分析，美国光身稻Lemont和丽江新团黑谷（LTH）组合中对B31生理小种的抗性属于数量性状遗传。由于所筛选到的两个共分离标记分别位于第11号和第8号染色体上，从F2群体中随即挑取了180个单株，对4、6、8、11、12五条染色体作图。部分多态性标记群体见图1和图2。

（五）对第11号染色体的QTL分析

用5条染色体上的多态性标记进行检测180株F2水稻的DNA，分别以病斑数目和病叶面积百分数为表型性状作图，结果见表6和图3。结果表明，在11号和第8号染色体检测到抗性QTL，其LOD值均在10以上；以病斑数目为表型性状检测，发现11号染色体上有2个QTL（qtl1、qtl2），两个峰分别位于RM27373与RM27384和RM27381与RM6904之间。以病叶面积百分数为表型性状检测，结果在8号染色体上检测到两个与病叶面积相关的qtl（qtl3、qtl4）；qtl3在标记RM5985和标记RM80之间，qtl4在标记RM5985和RM223之间，在11染色体上没有检测到。在8号和11号两条染色体上添加标记后作图，见表4-6。

以控制病叶面积大小为表型性状，通过复合区间做图，结果在8号染色体上SSR标记RM223附近检测到二个控制病叶面积的qtl（qtl3、qtl4）及11染色体上的两个qtl。

三、问题与讨论

本研究以病斑数和病叶面积为表型性状，将抗苗瘟的两个与病斑数相关的QTL定位在11号染色体上RM27384和RM27373之间及RM6904与RM27381之间；将两个与病叶面积相关的QTL定位在第8号染色体上RM80与RM5985及RM5985与RM223之间；但是这几个QTL对抗病性的贡献率都很低，最高的一个只有24%；最低的一个只有6.8%，因此，Lemont对稻瘟病的抗性可解释为主效QTL加微效QTL共同作用的结果。初步定位的几个QTL离最近的分子标记距离较大；在实际育种中尚有较大差距，可以通过进一步研究，开发出更近的紧密连锁的分子标记用以抗性基因的检测。

本研究表明五个四川水稻品种均具有多个抗稻瘟病基因，在今后的水稻育种中都是很好的抗性资源，这些水稻品种分别进行杂交就可以实现抗性基因的转移和发挥其抗性育种的价值。然而田间观察到的数据还受天气等自然环境、时空条件的影响，还需进行连续的大田观测和抗菌实验的进一步验证。