补阳还五汤精简方对氧化应激损伤血管内皮细胞保护作用研究

邵乐 夏相宜 王宇红 蔡光先 佘颜

〔摘要〕 目的 观察补阳还五汤精简方对氧化应激损伤后血管内皮细胞的保护作用，并从核转录因子E2相关因子/抗氧化反应元件（NF-E2-related factor 2/ antioxidant response element，Nrf2/ARE）途径探讨其作用机制。方法 采用H2O2作用大鼠血管内皮细胞4 h建立体外血管内皮细胞氧化应激模型，根据不同处理分成正常组，模型组，补阳还五汤含药血清组（补阳组），补阳还五汤精简方含药血清组（5%精简组、10%精简组、20%精简组）6组。采用倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞术检测血管内皮细胞调亡;测定细胞SOD活力、MDA含量;采用Western blot法检测细胞Nrf2、血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表达。结果 与模型组比较，含药血清组均能不同程度改善细胞形态，升高细胞存活率，其中10%精简组较5%精简组、20%精简组细胞损伤程度低;与模型组比较，补阳组和10%精简组可有效抑制细胞凋亡 （P<0.05）;与模型组比较，补阳组及10%精简组可显著提升SOD活力（P<0.01）;补阳组、10%精简组及20%精简组可降低MDA含量（P<0.05）;补阳组及10%精简组可明显上调Nrf2、HO-1蛋白表达 （P<0.05）。结论 10%补阳还五汤精简方可以显著减轻氧化应激造成血管内皮细胞的损伤，抑制细胞调亡，这一作用可能与上调Nrf2/ARE抗氧化信号通路途径表达有关。

〔关键词〕 补阳还五汤精简方;氧化应激;血管内皮细胞;核转录因子E2相关因子2;血红素加氧酶-1

〔中图分类号〕R285.5;R393       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.004

有研究表明，氧化应激造成的内皮细胞损伤在缺血性脑损害中起关键作用，是造成脑缺血/再灌注不可逆损伤的主要因素[1-2]。转录因子E2相关因子/抗氧化反應元件（NF-E2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE）抗氧化信号通路是机体重要的内源性抗氧化应激通路，在内皮细胞氧化应激损伤中发挥重要调控作用[3]。因此，研究氧化应激对血管内皮细胞的损伤机制，并以此为靶点寻找保护血管内皮细胞的有效药物，对缺血性脑血管疾病的防治具有重要意义。

补阳还五汤精简方是课题组在多年临床经验的基础上，遵循补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法精简方药，并且配合醇提、超临界CO2提取工艺制备而成。前期动物实验研究表明补阳还五汤精简方通过调控Nrf2/ARE信号通路发挥抗脑缺血的作用[4]。本实验在前期研究的基础上，进一步观察该方对氧化应激损伤后血管内皮细胞保护作用及可能机制。

1 材料

1.1  细胞和动物

大鼠血管内皮细胞株（bEnd.3细胞株）由长沙唯尔生物技术有限公司提供。SPF级SD大鼠，体质量250～280 g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2  药材

补阳还五汤处方（生黄芪120 g，当归尾6 g，川芎3 g，红花3 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，地龙3 g）和补阳还五汤精简方处方（黄芪30 g，川芎9 g，地龙6 g），补阳还五汤按传统水煎后浓缩干燥制备成干浸膏（每1 g干浸膏相当于原生药4.5 g），补阳还五汤精简方采用醇提、超临界CO2提取工艺制备干浸膏（每1 g干浸膏相当于原生药4.7 g），以上干浸膏均由湖南中医药研究院中药所提供。

1.3  主要试剂和仪器

DMEM 培养基（Hyclone公司）;胎牛血清（Gibco公司）;MTT（Sigma公司）;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物有限公司）;SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）;兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体、兔抗大鼠血红素加氧酶-1（HO-1）多克隆抗体（Abcam公司）;兔抗大鼠GAPDH 多克隆抗体（上海拜力生物科技有限公司）。YT-CJ-2NB型超净工作台（北京亚泰科隆公司）;DSZ2000X型倒置生物显微镜（北京中显恒业仪器仪表有限公司）;MB-530型酶联免疫检测仪（深圳汇松有限公司）;FACSAriaII型流式细胞仪（美国BD公司）;Bx51光学显微镜及IPP6.0图像分析系统（日本Olympus公司）;MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）;mini protean 3 cell电泳仪（美国BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1  含药血清制备

大鼠适应性喂养3 d后随机分为补阳组、精简方组和对照组，每组5只。根据相关文献研究[5]，药物组予以相当于人临床用量的6倍剂量给药，补阳组大鼠剂量换算后约为18 g/（kg·d），精简组大鼠剂量换算后约12 g/（kg·d），正常组用等容量生理盐水。均为每天2次，连续灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，无菌条件下，腹主动脉取血，3 500 r/min，离心20 min，取上清，56 ℃灭活30 min，0.22 μm微膜滤过除菌后，置-20 ℃保存备用。

2.2  细胞培养

大鼠血管内皮细胞培养于10% FBS的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，单层融合达80%左右，胰酶消化细胞，一分为二进行细胞传代。待状态稳定后移至96孔培养板上，分组实验。

2.3  细胞分组和处理

取生长良好的细胞制成细胞悬液，细胞生长至密度90%左右，接种于96孔培养板中，37 ℃、5%C02培养。将补阳还五汤含药血清配制成10%浓度，而补阳还五汤精简方含药血清配制成5%、10%、20% 3个浓度。采用300 μmol/L的H2O2作用血管内皮细胞4 h建立细胞氧化应激模型。细胞设6组：（1）正常组;（2）H2O2模型组;（3）补阳组（H2O2模型+10%补阳含药血清）;（4）5%精简组（H2O2模型+5%补阳还五汤精简方含药血清）;（5）10%精简组（H2O2模型+10%补阳还五汤精简方含药血清）;（6）20%精简组（H2O2模型+20%补阳还五汤精简方含药血清）。将细胞与药物共同作用2 h后，3 000 r/min离心后，收集各组细胞上清液进行检测。

2.4  形态学观察

将各组细胞置于倒置显微镜下观察各组细胞形态变化，并拍片记录。

2.5  细胞凋亡检测

将收集的各组细胞置于PBS中洗涤2次，2 000 r/min下离心5 min，收集1×105～5×105细胞;加入 500 μL的Binding Buffer悬浮细胞;加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀;室温、避光、反应5～15 min;在1 h内，采用流式细胞仪进行观察和检测。

2.6  细胞 SOD 活力和MDA 含量的检测

按“2.3”中的分组进行相应处理后，收集细胞，离心收集上清液。采用专用试剂盒检测SOD活力和MDA含量，按试剂盒检测说明书严格操作。

2.7  细胞Nrf2、HO-1的蛋白表达的检测

将裂解液融化、分装，离心得到蛋白抽提物，并用BCA法定量。备胶、凝胶电泳、转膜、封闭。加入一抗4 °C孵育过夜，一抗包括兔抗大鼠Nrf2（1∶600），兔抗大鼠HO-1（1∶600），洗膜后加入HRP标记的二抗（1∶4 000）孵育，用ECL系统进行发光和观察。采用美国BioRad公司生产Quantity one 4.5.0.软件系统分析各条带的灰度值，记录每条蛋白电泳带的灰度值与相应的内对照GAPDH灰度值的比值， 进行定量分析。

2.8  统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行分析。所有实验数据均经过方差齐性检验和正态性检验，计量资料用“x±s”表示，相同时间点的比较采用独立样本t检验或方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1  形态学观察

正常组血管内皮细胞饱满，大小均匀，胞核比較清晰，细胞呈铺路石样紧密排列。H2O2模型组细胞呈多角形，轮廓不清晰，核周围可见深色颗粒，同时可见一些细胞碎片，细胞存活率较正常组明显降低，含药血清处理组细胞存活率不同程度升高，其中10%精简组含药血清处理组较5%、20%精简组细胞损伤程度低。

3.2  不同含药血清对H2O2处理血管内皮细胞后细胞凋亡的影响

相较于正常组，模型组细胞发生明显的凋亡现象（P<0.01）。补阳组和10%精简组抑制凋亡的效果明显，凋亡率与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3.3  不同含药血清对H2O2处理血管内皮细胞后细胞内SOD 活力、MDA 含量的影响

与正常组比较，模型组SOD活力明显降低（P<0.01），MDA含量显著升高（P<0.01）;与模型组比较，补阳组及10%精简组能升高SOD活力（P<0.01），降低MDA含量（P<0.05）。见表2。

3.4  不同含药血清对H2O2处理血管内皮细胞后细胞内Nrf2、HO-1蛋白的影响

正常组中Nrf2、HO-1蛋白呈少量表达，模型组Nrf2蛋白表达与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）。补阳组及10%精简组明显上调Nrf2、HO-1蛋白表达，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。表3。

4 讨论

正常血管内皮细胞形态上紧密相连，在维持血管壁通透性完整、保持血管舒张收缩平衡、抗血栓形成及减轻血管炎症反应等方面发挥着重要的调节作用。血管内皮细胞损伤是缺血性脑血管疾病病理学基础，在众多损伤因素中，氧化应激反应是导致内皮细胞损伤的始动因素和关键环节，干预血管内皮细胞氧化应激损伤已成为治疗心脑血管疾病的主要途经[6-8]。

Nrf2/ARE抗氧化信号通路是机体重要的内源性抗氧化应激通路，Nrf2属于CNC（cap-n-collar）转录因子家族成员，该因子在生理状态下与Keap1 结合处于失活状态，氧化应激刺激Nrf2与 Keap1解偶联并在多种蛋白激酶的磷酸化作用下，Nrf2 进入细胞核与抗氧化反应元件（ARE） 结合，启动 HO-1 基因转录，发挥强大的抗氧化作用。有研究表明Nrf2/ARE抗氧化信号通路中的关键分子Nrf2、HO-1参与不同来源氧自由基诱导血管内皮细胞损伤的保护作用[9-11]。

体外氧化应激细胞模型成功建立是从细胞分子基因水平研究缺血缺氧性损伤的前提，其能准确模拟体内脑缺血时自由基增多这一环境，有助于研究脑缺血后氧化应激机制以及抗氧化应激药物的作用靶点。本文采用H2O2作用血管内皮细胞模拟氧化应激条件下血管内皮细胞的损伤[12-13]，实验表明：在H2O2刺激下， 细胞明显损伤，这种损伤变化可能与SOD 活力降低、MDA含量升高有关，提示氧化应激加剧内皮细胞的脂质过氧化反应，导致内皮细胞的损伤。同时，氧化应激刺激Nrf2/ARE抗氧化信号通路中关键分子Nrf2及HO-1表达增多，从而发挥抗氧化效应。

补阳还五汤为已证实可有效抑制早期神经功能恶化[14]，且P13K-Akt信号通路的调控可能是关键机制之一[15]。补阳还五汤精简方由黄芪、川芎等组成，遵循补阳还五汤之方义，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的观念而组方，并且配合醇提、超临界CO2提取工艺制备，以组建一种物质基础明确、药效相当甚至更优于原方的新型复方。本实验将不同浓度（5%、10%、20%）的补阳还五汤精简方含药血清与H2O2损伤的血管内皮细胞共培养，结果10%补阳还五汤精简方含药血清能明显促进血管内皮细胞增殖，抑制血管内皮细胞凋亡，且显著提高SOD活性，降低MDA含量，提示补阳还五汤精简方通过增强脂质抗氧化酶活性而拮抗氧化应激诱导的血管内皮细胞损伤，从而发挥对血管内皮细胞保护作用。10%补阳还五汤精简方含药血清能上调 Nrf2-ARE信号通路中Nrf2、HO-1蛋白的表达，推测补阳还五汤精简方可激活内源性抗氧化应激通路，进而增强血管内皮细胞抗氧化应激损伤能力，进一步丰富了补阳还五汤抗氧化应激的作用机制。

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