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七味白术散对轮状病毒感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞核内抗病毒蛋白表达的影响

2019-09-10左胜男伍参荣陈超龙刘碧源申可佳谭晓凤蔡锐李珊

湖南中医药大学学报 2019年2期
关键词:细胞核轮状病毒小肠

左胜男 伍参荣 陈超龙 刘碧源 申可佳 谭晓凤 蔡锐 李珊

〔摘要〕 目的 探讨七味白术散对轮状病毒(human rotarirus, HRV)感染乳鼠小肠黏膜上皮内淋巴细胞(iEL) CD3+T细胞核内抗病毒蛋白表达的影响,进一步阐明该方抗HRV机制。方法 选取5日龄NIH乳鼠168只,随机分为7组,正常对照组(N组)常规喂养,其余各组建立HRV腹泻模型,并分别灌服生理盐水(M组)、七味白术散(B组)、病毒唑(Z组)、抑制剂(Y组)、七味白术散加抑制剂(BY组),病毒唑加抑制剂(ZY组);分别于用药后32、40、48 h取各组乳鼠小肠黏膜,采用Western blotting方法测定小肠iEL CD3+T细胞核中双链RVA依赖的蛋白质激酶(PKR)、真核翻译起始子2的α亚基(eIF-2α)、2',5'-寡腺苷酸合成酶(OAS),RNA酶L(RNaseL)蛋白的表达。结果 B组乳鼠小肠粘膜iEL胞核中PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表达48 h时明显高于N组、M组、Y组、BY组、ZY组以及Z组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 七味白术散能促进感染乳鼠小肠黏膜iEL CD3+T细胞核中抗病毒蛋白PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL的表达,从而实现对HRV的清除作用。

〔关键词〕 七味白术散;轮状病毒;抗病毒蛋白;PKR; eIF-2α

〔中图分类号〕R289.3       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.007

轮状病毒(human rotavirus, HRV)是导致5岁以下婴幼儿急性腹泻和死亡的重要病原体,全世界每年大约50万儿童死于该疾病[1],如何防治轮状病毒感染性腹泻也成为当前医学研究的热点。目前对于轮状病毒肠炎尚无特效治疗药物[2],中药复方七味白术散(人参、白术、茯苓、甘草、葛根、藿香、木香)源自宋朝钱乙《小儿药证直诀》,是治疗小儿腹泻的经典方剂[3]。临床和实验研究均表明,其对轮状病毒引起的腹泻有很好的治疗作用[4-9]。

抗病毒蛋白(AVP)是由干扰素(IFN)通过JAK/STAT信号转导途径与相应的受体结合,激活信号级联反应诱导产生的。AVP包括双链RNA依赖的蛋白激酶(PKR)、2',5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)、Mx蛋白等。其中最主要的是PKR和OAS:活化的PKR作用于真核细胞翻译起始子2的α亚基(eIF-2α),使之磷酸化,从而使病毒肽链的合成受阻[10-13];OAS能够活化RNA酶L(RNaseL),降解病毒mRNA[14]。

前期研究已经从基因表达的水平证实了七味白术散能增强HRV感染乳鼠小肠黏膜上皮内淋巴细胞(iEL)IFN-γ及IFN-γR mRNA表达水平,本实验通过观察其对HRV感染乳鼠小肠iEL CD3+T细胞核内AVP表达的影响,进一步为该药治疗HRV感染提供依据。

1 材料与方法

1.1  实验动物

取5日C57BL/6乳鼠168只,由湖南中医药大学医学实验动物中心集体购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号SYXK(湘)2013-0005。小鼠购回后置消毒鼠盒中饲养,消毒牛奶人工喂养,保持室温20~25 ℃。

1.2  药物

七味白术散(组成:人参7.5 g,白术15 g,茯苓15 g,葛根15 g,藿香15 g,木香6 g,甘草3 g)药材均购自湖南中医学院中医门诊部医林药号。用自来水-单蒸水-双蒸水分别洗3次,放入三角瓶中,加4倍体积的三蒸水浸泡2 h(人参另泡另煎),煎2次,每次煎30 min。去渣,两煎液混合,G4滤器过滤,于60 ℃水浴中浓缩成每毫升含原生药1 g的药液,密封,隔水煮沸消毒;病毒唑,天津药业焦作有限公司,批号:10060112,给药前用生理盐水稀释成1.4 mg/mL;蛋白酪氨酸激酶抑制剂Genistein:给药前用DMSO溶解后用生理盐水稀释成5 mg/mL。

1.3  细胞与病毒

MA104细胞,人轮状病毒 HRV(Wa株)由中国科学院预防医学中心段昭军教授赠送。MA104细胞主要用于HRV(Wa株)扩增,扩增后的病毒保存于液氮,供实验造模用。

1.4  试剂及仪器

HRV抗原ELISA试剂盒(武汉博士德公司); NE-PER胞质胞核提取试剂盒(美国PIERCE公司);蛋白定量试剂盒(Thermo,USA.);兔抗小鼠PKR、eIF-2α和羊抗小鼠OAS、 RNaseL(Santa Cruz公司);小鼠β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的相应二抗(羊抗兔IgG、兔抗羊IgG)(康为公司),ECL显色液。凝胶电泳仪(DYY-Ⅲ型,北京六一仪器厂),转移电泳槽(VE-186,上海天能)。

1.5  HRV感染乳鼠模型的制备与分组

将168只乳鼠随机抽出24只乳鼠作为正常对照组(N组),其余乳鼠参照文献[8]经口感染,50 μl/只(浓度100TCID50/100 μL)HRV懸液,N组乳鼠滴入等量细胞生长维持液。HRV感染24 h后,造模组乳鼠均出现不同程度的腹泻,肛周有大便污染痕迹。收集乳鼠粪便,用鼠轮状病毒抗原ELISA试剂盒(上海一基实业有限公司产品)检测粪便中HRV抗原,拟确定造模成功。

造模成功后的乳鼠,再按随机数字法,将造模成功的乳鼠分为 HRV腹泻模型,并分别灌服生理盐水(M组)、七味白术散(B组)、病毒唑(Z组)、抑制剂(Y组)、七味白术散加抑制剂(BY组)、病毒唑加抑制剂(ZY组),每组24只,加上N组(给予生理盐水)共7组,分别于造模给药后的32、40、48 h处死乳鼠取小肠组织以及小肠淋巴细胞检测抗病毒蛋白。每个时间段检测分析8只乳鼠。

1.6  标本采集

分别在给药后32、40、48 h 3个时间点断头处死各组乳鼠后,立即取出回盲部至幽门的全部小肠,剥离去除肠系膜和脂肪组织,用Hanks液漂洗。

1.7  CD3+T淋巴细胞的分离

按文献[15]方法将小肠经Hanks液漂洗后,切成1 cm的片段,加入15 mL含2% FCS的RPMI-1640液,置37 ℃水浴震荡30 min,取出后再用力震荡15 s,静置2 min,待肠片下沉,收集所有液体,用150目钢网过滤2次,收集滤液,将滤液装入事先制好的尼龙毛柱中流过,收集所有滤过的液体,浓缩制成2×107个/mL的单细胞悬液,将此单细胞悬液于4 ℃ 80×g离心5 min以去除杂质,再经45%和70% Percoll制成的梯度分离液离心90×g,25 ℃ 20 min,收集45%与70%界面层细胞,用含5% FCS的RPMI-1640洗3次,过免疫磁珠,分离出CD3+T淋巴细胞,备用。

1.8  Western blotting方法测定PKR、eIF-2α、OAS, RNaseL蛋白含量

操作步骤:(1)按试剂盒说明抽提CD3+T淋巴细胞胞核中的蛋白质;(2)按试剂盒的说明对抽提出的胞核蛋白定量;(3)配制12%分离胶,4%的浓缩胶,上样,120V下电泳2 h,至溴酚兰迁移到分离胶底部;(4)转膜,60V转移2 h;(5)5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜,加入相应的一抗(抗PKR多抗1∶500,抗eIF-2α多抗1∶500,抗OAS多抗1∶500,抗RNaseL多抗1∶500)室温孵育2 h,TBS洗3次,加入二抗(羊抗兔IgG、兔抗羊IgG,用量1∶500)室温2 h,TBS洗3次;(6)DAB室温显色1~5 min,仪器扫描保存结果;(7)用凝胶图像分析软件Gel-Pro analyzer 4.0对目标带的分子量和净光密度值进行分析,以β-actin作为内参,以目标蛋白与β-actin的IOD(累计光密度)比值计算蛋白相对表达量。

1.9  免疫组化测定PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表达

操作步骤:(1)新鲜小肠样本固定于甲醛溶液中;(2)石蜡包埋小肠样本并切片;(3)石蜡切片置于67 ℃烘箱中,烘片2 h,脱蜡后加3%H2O2,室温下孵育10 min;(4)一抗室温孵育2 h;(5)二抗孵育30 min;(6)DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5 min;(7)苏木素复染,0.1%HCl分化,自来水冲洗,蓝化,切片经梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固,晾干后拍照观察分析。

1.10  统计学方法

本实验中测得指标均为计量指标,用“x±s”表示,采用SPSS 16.0软件包进行统计分析,组间比较用方差分析,两两比较用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  乳鼠小肠黏膜组织iEL CD3+T细胞核中PKR蛋白表达

表1结果提示B组PKR蛋白表达随时间变化,32 h后逐渐升高,40 h达到顶峰,48 h下降(P<0.05);B组PKR蛋白表达均高于Z组(P<0.05)。BY组PKR蛋白表达高于Y组和M组(P<0.05);Y组低于M组(P<0.05)。ZY组的32 h PKR蛋白高于M组(P<0.05);而40 h、48 h PKR蛋白与M组比较无统计学意义(P<0.05)。

2.2  乳鼠小肠黏膜组织iEL CD3+T细胞核中eIF-2α蛋白表达

从表2结果可以看出HRV感染后的不同时间乳鼠iELCD3+T细胞核中eIF-2α蛋白相对表达量有统计学意义(P<0.05)。B组乳鼠小肠黏膜iEL细胞核中 eIF-2α蛋白表达明显高于N组、M组、Y组、BY组和ZY组(P<0.05);B组eIF-2α蛋白表达量用药32 h后逐渐升高,40 h达顶峰,48 h下降,3个时间点比较有统计学意义(P<0.05)。B组与Z组比较差异有统计学意义(P<0.05);Z组各时间点eIF-2α蛋白表达与B组比较(P<0.05)。BY组eIF-2α蛋白表达高于Y组和M组(P<0.05);Y组、ZY组各时间点eIF-2α蛋白表达均低于M组差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3  乳鼠小肠黏膜组织iEL CD3+T细胞核中OAS蛋白表达

表3结果可以看出不同时间点HRV感染乳鼠iELCD3+T细胞核中OAS蛋白相对表达量差异有统计学意义(P<0.05)。B组乳鼠小肠黏膜iEL胞核中各时间点OAS蛋白表达均明显高于N组、M组、Y组、BY组和ZY组(P<0.05);B组乳鼠OAS蛋白表达随时间变化逐渐升高,40 h达到顶峰,48 h下降(P<0.05);B组OAS蛋白表达与Z组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。BY组OAS蛋白表达高于Y组和M组(P<0.05);40 h、48 h Y组、ZY组OAS蛋白表达分别与M组比较差别无统计学意义(P<0.05)。

2.4  乳鼠小肠黏膜组织iEL CD3+T细胞核中RNaseL蛋白表达

表4各組不同时间点HRV感染乳鼠iEL CD3+T细胞核中RNaseL蛋白相对表达量有统计学意义(P<0.05)。B组乳鼠小肠黏膜iEL胞核中各时间点RNaseL蛋白表达均明显高于N组、M组、Y组、BY组和ZY组(P<0.05);B组RNaseL蛋白表达随时间变化,32 h后逐渐升高,40 h达到顶峰,48 h下降(P<0.05);32 h时,B组与Z组比较差异无统计学意义(P>0.05);40、48 h时,B组RNaseL蛋白表达均高于Z组(P<0.05)。BY组RNaseL蛋白表达高于Y组和M组(P<0.05);Y组RNaseL蛋白表达高于ZY组(P<0.05);40、48 h ZY组与M组比较差别无统计学意义(P>0.05)。

2.5  免疫组化观察乳鼠小肠组织PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表达

40 h时, M组小鼠其小肠组织PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表达与N组相比不明显。B组小鼠其小肠组织PKR、eIF-2α、OAS、RNaseL蛋白表达高于N组,M组和Z组小鼠,免疫组化结果与Western blotting结果相似。

4 讨论

秋末冬初,气候转冷,小儿在“脏腑柔弱”“成而未全,全而未壮”“脾常不足”的基础上,感受风寒,致脾胃功能失常,水反为湿,谷反为滞,水谷并走大肠而致泄泻;“脾虚”“湿胜”为其病理基础。七味白术散原名白术散,由人参、白茯苓、炒白术、藿香叶、木香、甘草、葛根组成,由北宋“儿科之圣”钱乙创制。此方以人参、白术、甘草之甘温,补胃和中;木香、藿香辛温以助脾,茯苓甘淡,分阴阳,利水湿,葛根甘平,倍于众药,其气轻浮,鼓舞胃气,上行津液,又解肌热,是治脾胃虚弱泄泻之圣药。

轮状病毒是一种双链RNA病毒,其主要通过诱导TLR3高表达,从而激活下游炎症信号通路,引起炎症因子释放[16-17]。团队前期研究表明,轮状病毒主要通过激活TLR3通路及下游NFκB通路,进而激活炎症反应并释放炎症因子等,在这一过程中TLR3下游MyD88发挥关键作用[18]。七味白术散主要通过选择性阻断MyD88,从而抑制下游通路,进一步缓解轮状病毒引起的炎症因子释放。在此过程中七味白术散对TLR3无显著作用。在轮状病毒引起变化的诸多细胞因子中,IFNγ被认为是一种主要的抗轮状病毒的细胞因子,轮状病毒腹泻小儿升高的IFNγ水平与疾病的缓解相关[19]。但是,目前关于IFNγ介导轮状病毒引起腹泻的机制,以及七味白术散是否对IFNγ下游信号蛋白产生影响等问题还尚未见报道。

DM Bass[20]发现lFNγ能阻止轮状病毒侵入小肠细胞,并抑制其在人类小肠Caco2细胞的复制。IFNγ通过JAK-STAT途径与相应的受体结合,激活信号级联反应,诱导AVP生成,从而干扰病毒的感染和复制。AVP包括PKR、OAS、RNase L、RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)和Mx蛋白。其中最主要的是PKR和OAS,这两种酶的激活均需要病毒复制过程中产生的双链RNA。PKR是典型的干扰素诱导的抗病毒蛋白[21],具有调节先天免疫的作用[22]。在绝大多数细胞中,PKR有一定水平的基础表达,IFN可通过JAK-STAT途径诱导PKR的转录。PKR的氨基末端含有2个保守的dsRNA结合位点,dsRNA能够活化PKR,导致PKR的构象改变,激活PKR的激酶活性,活化的PKR能够识别蛋白质合成的起始因子eIF-2,并使eIF-2的α亚基51位丝氨酸磷酸化,磷酸化后的eIF失去启动蛋白质翻译过程的能力,使病毒肽链的合成受阻[23-24]。PKR参与机体的抗病毒机制,还与细胞凋亡密切相关,其机制主要是上调Fas配体等TNF受体家族成员,死亡信号转导分子FADD以及促凋亡的Bax分子的表达,该作用也可通过eIF-2α和NF-κB介导[25-27]。OAS在静止细胞中低水平存在,IFN作用时能被强烈诱导。病毒来源的dsRNA能够激活OAS,OAS在被双链RNA激活后,OAS蛋白将ATP聚合成pppA(2cp5cA)n(n=1或n>1)寡聚体,进而激活潜在的RNaseL,RNaseL能够降解病毒mRNA,因此,抑制了以RNA作为中介的病毒复制[28]。

本实验研究表明,七味白术散能促进HRV感染乳鼠小肠粘膜iEL胞核中IFNγ下游AVP蛋白的表达。抗病毒蛋白PKR和OAS共同作用,阻断病毒蛋白质合成并降解病毒mRNA,这可能是七味白术散治疗HRV感染性腹泻的重要机制。

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