活血散结方含药血浆对视网膜色素上皮细胞毒性作用的研究

潘坤 彭俊 吴佳敏 张又玮 李建超 吴权龙 彭清华

〔摘要〕 目的 制备活血散结方含药血浆，并研究其不同浓度对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的毒性作用。方法 以成年健康家兔为对象，制备活血散结方含药血浆。将提取的兔原代RPE细胞分9个组，分别为：空白对照组、正常血浆组、5%含药血浆组、10%含药血浆组、20%含药血浆组、40%含药血浆组、60%含药血浆组、80%含药血浆组、100%含药血浆组，予以相对应浓度的含药血浆干预，CCK8法检测含药血浆对兔RPE细胞毒作用。结果 活血散结方各浓度含药血浆对RPE细胞有抑制作用，其中5%～20%含药血浆对RPE细胞有较弱的抑制作用，但与正常血浆比较，抑制率差异无统计学意义（P>0.05）;而40%～100%含药血浆对RPE细胞生长有明显的抑制作用，与正常血浆比较，抑制率差异有统计学意义（P<0.05）。结论 活血散结方含药血浆对RPE细胞有一定的抑制作用，抑制程度与含药血浆浓度成量效关系，可以考虑选择5%～20%含药血浆浓度作为后续实验研究的干预浓度。

〔关键词〕 活血散结方;视网膜色素上皮细胞;细胞毒性;含药血浆

〔中图分类号〕R285.5;R276.7       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.003

增生性玻璃体视网膜病变（proiiferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性视网膜脱离、糖尿病视网膜病变、玻璃体出血以及眼球后段穿通伤等眼底疾病的严重并发症，目前该病的发病率在逐年增加[1-3]。PVR的基本病理生理过程主要涉及细胞增生、细胞外基质（extracellular matrix， ECM）的合成和膜的收缩[4]。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞在PVR的发生和发展过程中起关键作用，是重要的介导细胞，也是目前建立PVR模型的主要细胞[5]。目前许多学者提出使用药物预防PVR的发展，主要目的在于抗增殖及炎症[6]，而这些药物例如秋水仙碱、5-氟尿嘧啶、地塞米松等，或处于实验临床阶段，或因其药物毒性、长期并发症等原因，真正应用于临床的很少，故尚无作为防治PVR的临床常规药物[7]。近年来，许多报道中药及其制剂防治PVR己取得不错疗效[8-12]。湖南中医药大学彭清华教授从中医学对PVR的认识及多年来的临床经验出发，在眼科水血同治的原则和基础上，提出活血散结方，已取得良好的疗效。本文将探讨不同浓度活血散结方含药血浆对兔RPE细胞活性的影响。

1 材料

1.1  实验动物

成年健康无眼疾青紫蓝兔4只，雌雄不限，体质量1.5～2.0 kg，由上海市松江区车墩实验动物良种场提供，动物许可证号：SXCK（沪）2012-0008。實验前行常规眼科检查（裂隙灯、间接眼底镜），排除眼内外疾患方进入实验。含药血浆制备：成年健康家兔8只，雌雄兼用，体质量1.5～2.0 kg，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK（湘）2015-0004。常规喂养，控制室温20～26 ℃，保持空气流通，相对湿度55%左右，实验前所有动物适应性饲养1周。

1.2  药物制备

活血散结方：由三七、丹参、海藻、昆布、鳖甲、地龙配伍组成，饮片由湖南中医药大第一附属医院药剂科提供。采用水煎法，分煎2次后混合药液浓缩至1.025 g/mL生药浓度，4 ℃以下保存。

1.3  试剂及仪器

1640培养基（美国Hyclone公司）;胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）;胰蛋白酶（美国GIBCO公司）;D-Hank液（美国GIBCO公司）;聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X 100，上海索莱宝公司）;荧光封片剂（Fluoromount-G，上海索莱宝公司）;小鼠抗兔广谱细胞角蛋白（南京vazyme公司）;羊抗兔Alexa Fluor 488（南京vazyme公司）;细胞增殖与毒性检测试剂盒（七海生物公司）。CO2细胞培养箱（美国Thermo公司3111）;倒置显微镜（德国Motic公司 AE31）;酶标仪（美国Bio-tek公司ELX800）。

2 方法

2.1  活血散结方含药血浆的制备

采用随机数字法将家兔分为活血散结方组、空白组，每组4只。根据人与家兔体表面积换算方法计算（人以60 kg体质量为标准，家兔以1.6 kg体质量为标准），按等效剂量换算法换算家兔活血散结方组的等效临床剂量为20.256 g/kg≈20.3 g/kg。空白组灌服蒸馏水，均为每日20 mL/kg灌胃，分早晚两次灌服，连续灌胃5 d。采血前禁食禁水12 h，末次给药2 h后，无菌条件下腹主动脉取血，收集血液于含3.2%枸缘酸钠1∶9真空采血管内，颠倒混匀后静置。在3 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液即为含药血浆。0.22 μm膜滤过分装，置于-70 ℃超低温冰箱保存。

2.2  兔原代RPE细胞的培养

采用酶消化法获取兔原代RPE细胞[13]。取青紫蓝兔耳缘静脉处空气栓塞法处死，无菌操作条件下摘除眼球，去净眼球表面筋膜，生理盐水充分冲洗，巩膜穿刺刀沿锯齿缘后2 mm处刺入，用显微剪环形剪开眼球前段，去除角膜、晶状体以及玻璃体，由视网膜周边至视乳头方向轻轻去除视网膜神经上皮层。将眼杯置于眼球托上，7-0线在四个方向缝合固定眼杯，PBS冲洗。滴加胰蛋白酶，放置细菌培养箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培养基终止反应。用吸管轻轻吹打眼球内壁使RPE细胞脱落分散，收集眼杯中细胞悬液于离心管中。胰酶消化，离心，弃去上清液，加入10%胎牛培养基将细胞吹打分散，将RPE细胞调整为4×104～5×104个/mL细胞的密度，并接种于25 mL培养瓶，在37 ℃、5%CO2和相对湿度90%的培养箱中培养。细胞贴壁后每3天更换培养液，直到细胞融合。当细胞贴壁铺满大部分瓶底即可进行传代培养。

2.3  兔原代RPE细胞的鉴定

Cytokeratin-8特异性抗体免疫荧光法[14]进行鉴定。将四片玻璃片盖于24孔板，每孔加1 mL培养基，取上述“2.2”对数生长期第2代细胞约5×104个/mL细胞进行爬片，置培养箱过夜。待细胞铺平贴壁后，用4%PFA于室温固定30 min。取50 μL破膜封闭液于防水膜上，盖于细胞上，室温放置1 h。取50 μL小鼠抗兔广谱细胞角蛋白一抗滴于防水膜上，盖于细胞上，放置4 ℃环境下过夜。将玻片取出用PBS冲洗。取羊抗兔二抗，滴50 μL于防水膜上，盖于细胞上，室温放置2 h，操作过程注意避光并保持细胞湿润。2 h后将玻片用PBS冲洗，吸干多余水分，封片并于荧光显微镜下进行观察。

2.4  CCK8法检测活血散结方含药血浆对兔RPE细胞的毒性作用

取96孔板培养板，平行接种9组：空白对照组、正常血浆组、5%含药血浆组、10%含药血浆组、20%含药血浆组、40%含药血浆组、60%含药血浆组、80%含药血浆组、100%含药血浆组，每组各设5个复孔。收集对数期RPE细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，5%CO2、37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入用无血清培养基配制的不同浓度的含药血浆，培养48 h。每孔加入10 μL试剂盒中7sea-cell counting kit溶液，同步设调零孔，继续培养2 h。用酶标仪检测450 nm处的吸光值（OD），并计算。

细胞增殖抑制率=[1-（实验组OD值/空白组OD值）]×100%。

2.5  统计分析

采用SPSS 17.0统计学软件对所有数据资料进行统计学分析，计量资料以“x±s”表示。行ANOVA单因素方差分析，样本间的两两比较用LSD检验或者Dunnett检验，P<0.05為差异有统计学意义。

3 结果

3.1  兔RPE细胞鉴定

Cytokeratin-8特异性抗体免疫荧光法结果显示：荧光显微镜下观察RPE细胞，荧光遍及胞质，细胞角蛋白染色呈强阳性。

3.2  含药血浆对RPE细胞生长情况的影响

倒置显微镜下观察细胞形态，空白对照组与正常血浆组细胞分布较为密集，实验各组中5%～20%含药血浆组细胞与正常组相比，细胞密度无明显减小;而40%～100%含药血浆各组细胞活性受到一定的抑制，细胞密度减小，并呈一定的量效关系。

3.3  CCK8法检测活血散结方含药血浆对兔RPE细胞的毒性作用

如表1所示，含药血浆干预RPE细胞48 h后细胞毒性检测结果显示为5%～20%的含药血浆组细胞活力OD值与正常组相比，差异无统计学意义（P>0.05），40%～100%的含药血浆各组细胞活力OD值与正常血浆组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。

4 讨论

中医学文献对PVR无相应病名的记载，缺乏对其病机的阐述，因其为有形之物，类似中医学“积聚”范畴，又因PVR各阶段症状差异，可归属于“暴盲”“云雾移睛”和“视瞻昏渺”范畴[15]。目前研究认为该病与“癥瘕”的病理病机相似[16]，与肝肾脾三脏密切相关[17]，同时彭清华教授还提出外伤PVR的病机为血水互结[18]。活血散结方由三七、丹参、鳖甲、地龙、昆布、海藻等中草药组成，方中三七化瘀止血活血，丹参活血祛瘀，入肝经血分，二药合用活血化瘀，共为君药;鳖甲软坚散结，入肝肾两经，与君药合用加强活血化瘀散结之功，为方中臣药;地龙通行经络，清热利水，昆布、海藻消痰软坚，利水消肿，入肝肾两经，三药合用助化痰软坚，利水散结之功。全方共奏活血化瘀、软坚散结之功，使眼内瘀血痰结之有形之物利散，改善眼底情况提高患者视功能。近年来研究发现活血散结方中中药多具有抗凝、抗纤维、抑制细胞异常增殖的作用[10，19]。

有研究表明，血浆药理学的半体内实验及体外细胞实验是目前中药复方药理机制有效的研究方式[20]。本研究采取血浆药理学方法[21]，不同浓度活血散结方含药血浆干预RPE细胞48 h后检测细胞毒性。倒置显微镜下观察细胞形态，发现5%～20%含药血浆干预的RPE细胞密度变化不大，而40%～100%含药血浆干预下的RPE细胞受到一定的抑制，细胞密度下降;CCK8法检测显示含药血浆对RPE细胞均有不同程度的抑制作用，且存在一定量效关系（正相关），其中5%～20%含药血浆对细胞有较弱的抑制作用，与正常血浆组比较，抑制率差异无统计学意义（P>0.05）;而40%～100%含药血浆对细胞生长有明显的抑制作用，与正常血浆比较，抑制率差异具有统计学意义（P<0.05）。综合考虑，活血散结方含药血浆可以一定程度抑制RPE细胞，可选择抑制率较低的5%～20%含药血浆浓度作为后续研究的干预浓度，进一步探讨PVR发生、发展过程中RPE细胞的作用机制。

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