菜粉蝶HSP20基因的克隆及温度胁迫下表达分析

袁远 张连根 高熹

摘要：【目的】克隆分析菜粉蝶（Pieris rapae）热激蛋白20基因（HSP20），并检测其在温度胁迫下的表达情况，为探析菜粉蝶适应温度胁迫机制提供参考。【方法】以菜粉蝶为试验材料，采用RT-PCR和RACE克隆获得菜粉蝶HSP20基因cDNA全长，并通过生物学软件分析其序列，明确其基因结构特征和亲缘关系;采用实时荧光定量PCR检测菜粉蝶HSP20基因在低温（-20～0 ℃）和高温（5～45 ℃）胁迫下的表达响应。【结果】菜粉蝶HSP20基因全长725 bp，5'-端非编码区105 bp，3'-端非编码区109 bp，开放阅读框531 bp，编码176个氨基酸，预测蛋白分子量19.5 kD，理论等电点6.61;其编码氨基酸序列中含有1个典型的HSP20家族结构域（位于第60～142位氨基酸）、1个α-晶体蛋白（位于第60～157位氨基酸）和1个Allato allatostatin（位于第14～24位氨基酸）;基序列相似度分析其与二化螟、家蚕和甘蓝夜蛾HSP20蛋白氨基酸相似度较高并聚为一族。该基因随环境温度的升高或降低发生变化，在-5和40 ℃诱发该基因高效表达。【结论】低温和高温均能诱导菜粉蝶HSP20基因高效表达。

关键词： 菜粉蝶;热激蛋白;HSP20;基因克隆;序列分析;温度胁迫;表达分析

中图分类号： S433.4                   文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0286-06

Abstract：【Objective】Heat shock protein 20 gene（HSP20） from Pieris rapae was cloned and its expression under temperature stress was detected. The result was helpful for further investigation of the adaptation mechanisms of P. rapae to high and low temperature stresses. 【Method】Full length cDNA of HSP20 gene of P. rapae was cloned by RT-PCR and RACE with P. rapae as materials. Its sequence was analyzed by biology software， and its gene structural sequence and genetic relationship were also studied. Response of HSP20 gene to low（-20-0 ℃） and high （5-45 ℃） temperatures were ana-lyzed by fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full-length of P. rapae HSP20 was 725 bp， and contained 105 bp 5'-noncoding region， 109 bp 3'-noncoding region， a 531 bp open reading frame（ORF），encoded 176 amino acids， with an estimated molecular mass of 19.5 kD and an theoretical isoelectric point（pI） of 6.61. In the encoded amino acid sequences， there was one typical HSP20 family domain（located at 60-142 amino acids）， one α-crystallin（located at 60-157 amino acids） and a Allato allatostatin（located at 14-24 amino acids）. The sequence similarities between P. rapae HSP20 and that of  Chilo suppressalis， Bombyx mori， Mamestra brassicae were high and they were clustered into one group. The HSP20 expressions changed with temperature， and high expressions of this gene was observed at -5 and 40 ℃. 【Conclusion】Low and high temperatures can lead to the high expression of P. rapae HSP20.

Key words： Pieris rapae; heat shock protein; HSP20; gene cloning; sequence analysis; temperature stress; expression analysis

0 引言

【研究意義】热激蛋白（Heat shock protein，HSP）又称应激蛋白或热休克蛋白，是生物有机体遇到高温等逆境刺激后大量产生的一类特定的应急蛋白，是生物体对逆境胁迫适应的重要组成成分，其普遍参与生物的各种生理代谢途径，对减轻逆境胁迫对自身的伤害起重要作用。HSP普遍存在于各种生物体内，对生物个体的生长、发育和生存发挥着重要作用（韩政等，2010;代玲玲等，2011;徐剑文等，2017;张响英等，2017）。随着全球气温的持续升高，高温胁迫对昆虫及其他生物的影响也越来越大，通过研究热激蛋白调控细胞使昆虫适应外界胁迫的机制，对揭示生物应对全球温室效应具有重要意义。【前人研究进展】目前，对于HSP尚无明确的分类标准，普遍认同Morimoto的划分方法，他将主要的HSP分为4个家族：HSP90（83～90 kD）、HSP70（66～78 KD）、HSP60和小分子HSP（15～30 kD）家族（Lindquist，1986）。近年来，已有系列文献报道各种昆虫HSP基因的克隆、表达分析及其功能鉴定研究，但这些研究主要集中在热休克蛋白家族的HSP70和HSP90，而针对小分子热休克蛋白的研究相对较少。HSP20是生物体应激反应诱导产生的主要蛋白质之一。多数应激反应使蛋白质结构受损，HSP20能够结合损伤的蛋白质，并预防胞浆内的蛋白质发生聚集，同时能迁移到核仁中，与细胞内的核糖体建立联系，达到保护细胞核蛋白质的作用。不同物种的HSP20基因具有高度保守的氨基酸序列，该特征亦为生物进化研究提供了一定的科学依据（Mehlen et al.，1996）。目前，已报道在家蚕（Bombyx mori）、小菜蛾（Plutella xylostella）、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）和二化螟（Chilo suppressalis）等昆虫中分离克隆出许多小分子HSP基因，这些基因在昆虫生长发育、生殖和应对环境胁迫中发挥重要作用（Li et al.，2009;Shen et al.，2011;夏晓峰等，2013;张青等，2014;Liu et al.，2018）。【本研究切入点】菜粉蝶（Pieris rapae）隶属鳞翅目（Lepioloptera）粉蝶科（Pierididae），分布于世界各地，主要危害甘蓝和白菜等十字花科植物。菜粉蝶对环境的适应能力极强，无论是在炎热的夏季还是寒冷的冬季均能生存。目前，有关菜粉蝶HSP20基因的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采用RACE-PCR从菜粉蝶中克隆HSP20基因，运用生物信息学方法对获得的菜粉蝶HSP20基因序列特征进行分析，同时采用实时荧光定量PCR检测在不同温度下该基因的表达情况，为深入揭示菜粉蝶对温度胁迫适应机制提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试菜粉蝶幼虫采集于云南农业大学后山農场甘蓝蔬菜地。主要试剂和药品：TRIzol试剂购自Invitrogen公司，Advantage 2 PCR Kit（Clontech）和Premix Ex TaqTM购自TaKaRa公司，pGEM®-T载体购自Promega公司，Taqman-MGB探针购自上海GeneCore生物技术公司。

1. 2 RNA抽提

采用TRIzol试剂提取菜粉蝶总RNA，分别用紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测其质量（Tachibana et al.，2005）。

1. 3 HSP20基因克隆

以提取的菜粉蝶总RNA为模板，用Smarttm RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）合成3'-和5'-RACE cDNA模板。根据对菜粉蝶cDNA文库测序得到HSP20基因片段序列，设计3'-RACE（5'-GGTG AATTTGGATGTCCAGCATTTCACT-3'）和5'-RACE（5'-CCTAGGAGCAATGACGGTCAGAACGCCAT-3'）引物。以RACE cDNA为模板，扩增菜粉蝶HSP20基因的中间片段序列。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。

根据扩增获得的菜粉蝶HSP20基因中间片段序列，设计其3'-RACE和5'-RACE引物，结合RACE试剂盒中的UPM引物（Universal Primer A Mix，UPM），PCR扩增获得该基因的3'-和5'-端序列。扩增程序：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。采用Advantage 2 PCR Kit（Clontech）进行PCR。

PCR产物经1%琼脂凝胶电泳检测，切胶并用AxyAprep DNA凝胶回收试剂盒（Biosciences）回收，将回收产物连接到pGEM®-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后进行蓝白斑筛选（Sonoda et al.，2006a）。将得到的阳性克隆菌液送金思特科技（南京）有限公司测序。

1. 4 基因序列分析

用Genetyx Ver. 8.0分析菜粉蝶HSP20基因核序列酸，推导氨基酸序列。用ClustalX（v1.83）程序进行多序列对比，用Motif scan对该序列中的蛋白质二级结构域进行预测（Rinehart et al.，2000）。

1. 5 温度胁迫下HSP20基因表达分析

将菜粉蝶虫体分别置于低温（-20、-15、-5和0 ℃）和高温（5、25、30、35、40和45 ℃）下1 h，每个温度值作为一个处理，其中室温25 ℃作为对照。合成的菜粉蝶cDNA作实时荧光定量PCR检测模板。用Primer 5.0设计定量引物（5'-ACTCGTGACCTTG GCTCCA-3'和5'-CCCTCTACCACGATGTATC-3'），以18S RNA为内参（5'-CAGTGATGGGATGAGTGC TTT-3'，R：5'-TACGCTATTGGAGCTGGAATT-3'），参照SYBR Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）说明进行定量扩增。扩增程序：95 ℃预变性10 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，进行40个循环。所有样品进行3次生物学重复。实时荧光定量PCR数据用 2-△△Ct方法进行分析（Livak and Schmittgen， 2001），基因表达量差异采用SPSS 20.0中的最小显著差法（LSD）检验，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2. 1 菜粉蝶HSP20基因序列分析结果

图1结果显示，菜粉蝶HSP20基因全长725 bp，5'-端非编码区105 bp，3'-端非编码区109 bp，开放阅读框（Open reading frame，ORF）531 bp，编码176个氨基酸，预测蛋白分子量19.5 kD，理论等电点（pI）6.61。该基因具有多聚腺苷酸信号（AATAAA），出现在核苷酸序列终止密码子下游68 bp处，且有ploy（A）尾巴。

通过Motif sacn分析（Sonoda et al.，2006b）发现，该蛋白中存在3个蛋白激酶C磷酸化位点（SIK60～62、SVK83～85和TRR112～114）、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（TPDD26～29和TPEE78～81）、1个典型的HSP20家族结构域（位于第60～142位氨基酸）、1个a-晶体蛋白（位于第60～157位氨基酸）和1个Allato Allatostatin（位于第14～24位氨基酸）。

2. 2 菜粉蝶HSP20蛋白同源性分析结果

菜粉蝶与其他昆虫的HSP20蛋白氨基酸多序列比对结果见图2。菜粉蝶与其他昆虫HSP20蛋白的氨基酸相似度比较结果（表1）显示，菜粉蝶与二化螟（C. suppressalis）、家蚕（B. mori）、甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae）、云杉卷叶蛾（Choristoneura fumiferana）、小菜蛾（P. xylostella）、东亚飞蝗（Locusta migratoria）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、腰带长体茧蜂（Macrocentrus cingulum）和美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）的HSP20蛋白氨基酸相似度分别为85%、84%、84%、72%、57%、48%、51%、46%和43%。

应用MEGA 4.0邻接法（NJ）对菜粉蝶和其他昆虫的HSP20蛋白氨基酸序列进行分析，并构建系统发育進化树，结果（图3）显示，菜粉蝶HSP20蛋白氨基酸序列以95%的支持率与家蚕、二化螟和甘蓝夜蛾聚为一族。

2. 3 温度胁迫下菜粉蝶HSP20基因的表达分析结果

通过实时荧光定量PCR分析菜粉蝶HSP20基因在低温和高温胁迫下的表达情况，结果（图4）显示，低温条件下菜粉蝶HSP20基因的表达量明显升高，在-5 ℃时达峰值，是对照组的1.76倍;高温条件下，在40 ℃时表达量明显升高，是对照组的2.75倍，差异达显著水平（P<0.05）。表明低温和高温胁迫均诱导菜粉蝶体内HSP20基因的高效表达。

3 讨论

HSP普遍存在于自然界的原核生物和真核生物中，其进化上相对保守。适宜条件下，其多数是作为分子伴侣帮助蛋白质正确折叠、移位、维持特定构象或参与蛋白质降解（任莉萍和曹小汉， 2006）。当机体受到外界环境刺激时，HSP基因的表达量常会大幅度提升，参与生物的细胞结构维持、更新、修复和免疫等环节，以提高生物体抵抗外来刺激的能力。鉴于HSP的免疫保护作用对生物有重要意义，因此一直是研究的热点（李斌，2001;申建茹等，2011;张青等，2014）。目前，已有系列文献报道各种昆虫HSP基因克隆、表达分析及初步功能鉴定研究（Multhoff，2007），但这些研究主要集中在HSP家族的HSP70和HSP90，而对小分子HSP的研究相对较少，已报道的仅有果蝇、家蚕和斜纹夜蛾等（寇利花等，2015）。随着测序技术的不断发展及测序成本的降低，将鉴定出越来越多的昆虫小分子HSP基因序列，而这些序列的鉴定将揭示该类蛋白在昆虫中的进化过程，为昆虫的系统进化研究提供新视野，同时为后续研究昆虫小分子HSP的功能提供必要基础。

本研究以其他昆虫HSP20基因保守区设计简并引物扩增菜粉蝶HSP20基因的中间片段，然后利用RACE技术获得全长cDNA。克隆得到的菜粉蝶HSP20基因结构分析结果表明，菜粉蝶HSP20基因全长725 bp，5'-端非编码区105 bp，3'-端非编码区109 bp，开放性阅读框531 bp，编码176个氨基酸，预测蛋白分子量19.5 kD，理论等电点6.61。经结构域预测分析发现，菜粉蝶HSP20蛋白中具有1个典型的HSP20家族结构域，可判断其属于HSP20家族成员。此外，Motif scan分析发现该菜粉蝶HSP20基因存在3个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，而蛋白质的磷酸化和脱磷酸化在细胞信号转导中起主导作用，推测这几个位点可能是HSP20基因完成其生理功能的结构基础;同源性分析结果显示，菜粉蝶HSP20蛋白以95%的支持率与家蚕、二化螟和甘蓝夜蛾聚为一族，说明HSP20基因在进化中具有高度的保守性;通过氨基酸序列比对得知，该基因5'-端在物种进化过程中保守性低。这些特征均与迄今已克隆获得的其他昆虫HSP20基因结构特征相似（Mehlen et al.，1996;Wang et al.，2012）。通过实时荧光定量PCR分析菜粉蝶HSP20基因在低温胁迫下的表达量发现，随着温度的下降表达量明显升高，在-5 ℃时菜粉蝶HSP20基因的表达量明显升高至峰值，随后开始降低;高温胁迫下，随着温度的升高表达量明显提高，在40 ℃时菜粉蝶HSP20基因的转录水平达峰值，随后开始降低。菜粉蝶HSP20基因的克隆分析为后续该虫的热激机制及对温度的胁迫适应机制研究提供分子生物学依据，并为进一步开展相关后续研究打下理论基础。

4 结论

菜粉蝶HSP20基因具有1个典型的HSP20家族结构域，存在3个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，与家蚕、二化螟和甘蓝夜蛾的HSP20基因有较高的同源性。环境温度胁迫能诱导HSP20基因大量表达。

参考文献：

代玲玲，彭德良，黄文坤，彭焕，龙海波，王高峰. 2011. 松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因（hsp90）克隆与序列分析[J]. 农业生物技术学报，19（5）： 916-923. [Dai L L， Peng D L，Huang W K，Peng H，Long H B，Wang G F. 2011. Cloning and sequence analysis of three new heat shock protein 90 gene（hsp90） from Bursaphelenchus xylophilus，B. mucronatus and B. doui[J]. Journal of agricultural Biotechnology，19（5）： 916-923.]

韩政，赵龙龙，陈光，马瑞燕. 2010. 热激蛋白与昆虫的耐热性关系研究进展[J]. 山西农业科学，38（8）：92-94. [Han Z，Zhao L L，Chen G，Ma R Y. 2010. Research advances of the relationship between heat shock proteins and Insects heat tolerance[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences，38（8）： 92-94.]

寇利花， 吴海花， 刘耀明， 张育平， 张建珍， 郭亚平， 马恩波. 2015. 镉急性染毒对中华稻蝗精卵巢小分子热休克蛋白基因表达的影响[J]. 农业环境科学学报，34（1）： 7-14. [Kou L H，Wu H H，Liu Y M，Zhang Y P，Zhang J Z，Guo Y P，Ma E B. 2015. Expression analysis of OcsHSP genes in testis and ovary of Oxya chinensis exposed to acute cadmium[J]. Journal of Agro-Environment Science， 34（1）： 7-14.]

李斌. 2001. 家蚕分子连锁图谱的构建和低分子量热激蛋白基因的克隆与特异表达[D]. 重庆：西南農业大学学报.[Li B. 2001. Constructin of the molecular linkage map and isolation，identification and specific expression of small heat-shock genes in silkworm， Bombyx mori[D].Chonɡqing：Southwest Agricultural University.]

任莉萍，曹小汉. 2006. 热休克蛋白研究进展[J]. 安徽农业科学， 34（10）： 2040-2042. [Ren L P，Cao X H. 2006. Study on heat shock protein[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 34（10）：2040-2042.]

申建茹， 李明福， 陈乃中， 王进军，万方浩. 2011. 苹果蠹蛾热激蛋白Hsp90基因的克隆及热胁迫下的表达分析[J]. 昆虫学报， 54（11）：1236-1248. [Shen J R，Li M F，Chen N Z，Wang J J，Wan F H. 2011. Cloning and analysis of the expression characteristics under heat stress of Hsp90 gene in the codling moth，Cydia pomonella（Lepidoptera： Tortricidae）[J]. Acta Entomologica Sinica，54（11）：1236-1248.]

夏晓峰， 林海兰， 郑丹丹， 杨广，尤民生. 2013. 小菜蛾热休克蛋白基因的鉴定及其表达模式分析[J]. 昆虫学报， 56（5）：457-464. [Xia X F，Lin H L，Zhen D D，Yang G，You M S. 2013. Identification and expression patterns of heat shock protein genes in the diamondback moth，Plute-lla xylostella（Lepidoptera：Yponomeutidae）[J]. Acta Entomologica Sinica，56（5）：457-464.]

徐剑文，赵君，刘剑光，肖松华. 2017. 芝麻全基因组Hsp70基因的鉴定与生物信息学分析[J]. 江苏农业学报，33（3）：493-502. [Xu J W，Zhao J，Liu J G，Xiao S H. 2017. Genome-wide identification and bioinformatics analysis of Hsp70 gene family in Sesamum indicum[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（3）：493-502.]

张青， 陆明星， 祝树德. 2014. 灰飞虱热激蛋白Hsp90基因的克隆、序列分析与表达模式[J]. 昆虫学报， 57（7）：777-786. [Zhang Q，Lu M X，Zhu S D. 2014. Cloning， sequence analysis and expression profiling of heat shock protein 90 gene in the small brown plant hopper， Laodelphax striatellus（Hemiptera： Delphacidae）[J]. Acta Entomologica Sinica， 57（7）：777-786.]

张响英，唐现文，陈静波，李腾腾. 2017. 热应激诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡及其对HSP70基因表达的影响[J]. 河南农业科学，46（8）：142-146. [Zhang X Y，Tang X W，Chen J B，Li T T. 2017. Effects of heat stress on apoptosis and expression of HSP70 mRNA in bovine mammary epithelial cells[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，46（8）：142-146.]

Li Z W，Li X，Yu Q Y. 2009. The small heat shock protein （sHSP）genes in silkworm，Bombyx mori and comparative analysis withother insect sHSP genes[J]. BMC Evolutionary Biology，9：215.

Lindquist S. 1986. The heat-shock response[J]. Annual Review of Biochemistry， 55（1）：1151-1191.

Liu Q N，Liu Y，Zhao Z X，Zhu X Y，Ge B M，Li C F，Wang D，Bian X G，Yang L，Chen L，Tian J W，Zhou C L， Tang B P. 2018. A small heat shock protein 21（sHSP21） mediates immune responses in Chinese oak silkworm Antheraea pernyi[J]. International Journal of Biological Macromolecules，111：1027-1031.

Livak K J， Schmittgen T D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method[J]. Methods，25：402-408.

Mehlen P，Schulze-Osthoff K，Arrigo A P. 1996. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1-and staurosporine-induced cell death[J]. Journal of Biological Chemistry，271（28）：16510-16514.

Multhoff G. 2007. Heat shock protein 70（Hsp70）：Membrane Iloca-tion，export and immunological relevance[J].Me-thods，43： 229-237.

Rinehart J P， Yocum G D， Denlinger D L. 2000. Developmental upregulation of inducible hsp70 transcripts， but not the cognate form， during pupal diapause in the flesh fly， Ssarcophaga crassipalpis[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 30（6）：515-21.

Shen Y，Gu J，Huang L H，Zheng S C，Liu L，Xu W H，Feng Q L，Kang L. 2011. Cloning and expression analysis of six small heat shock protein genes in the common cutworm， Spodoptera litura[J]. Journal of Insect Physiology，57（7）：908-914.

Sonoda S，Ashfaq M，Tsumuki H. 2006a. Cloning and nucleotide sequencing of three heat shock protein genes（hsp90，hsc70，and hsp19.5） from the diamondback moth， Plutella xylostella（L.） and their expression in relation to deve-lopmental stage and temperature[J]. Archives of Insect Biochemistry & Physiology， 62（2）：80-90.

Sonoda S，Fukumoto K，Izumi Y，Ashfaq M，Yoshida H，Tsumuki H. 2006b. A small HSP gene is not responsible for diapause and cold tolerance acquisition in Chilo supp-ressalis[J]. Journal of Applied Entomology，130（5）： 309-313.

Tachibana S，Numata H，Goto S G. 2005. Gene expression of heat-shock proteins（Hsp23，Hsp70 and Hsp90） during and after larval diapause in the blow fly Lucilia sericata[J]. Journal of Insect Physiology， 51（6）：641-647.

Wang H， Li K， Zhu J Y， Fang Q， Ye G Y. 2012. Cloning and expression pattern of heat shock protein genes from the endoparasitoid wasp， pteromalus puparum in response to environmental stresses[J]. Archives of Insect Bioche-mistry and Physiology，79（4-5）：247-263.

（責任编辑 麻小燕）