印度梨形孢最适培养基的筛选及其对水稻的促生作用研究

舒珊 高中南 袁听 陈强 朱志炎 何勇 叶开温 田志宏

摘 要：【目的】内生真菌印度梨形孢Piriformospora indica（Pi）可定殖在多种植物根系中，促进植物生长发育，增强植物抗逆性。【方法】 将印度梨形孢接种至8种供试培养基中，测定其在8种培养基中的生长速率，并将印度梨形孢与水稻幼苗共培养，分析印度梨形孢对水稻幼苗株高、叶长、根长、根数、鲜重和叶绿素含量等生物学性状的影响。【结果】 8种供试培养基中，V8培养基是最适合印度梨形孢生长的培养基，且加入一定量蔗糖能进一步促进印度梨形孢的生长;研究还发现，接种了印度梨形孢的水稻株高、叶长、根长、根数、叶绿素含量和地上地下部鲜质量都显著高于对照;与对照相比，接种印度梨形孢20 d后的水稻，其株高增高了32.36%，叶绿素含量提高了15.88%。【结论】 印度梨形孢是通过增加光合作用和增强根系生理机能，从而促进水稻的生长发育。

关键词：印度梨形孢;培养基;水稻;促生作用

中图分类号：S 154文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-155-07

0 引言

【研究意义】水稻是世界上最重要的粮食作物之一[1]，在生长过程中会受到各种生物和非生物逆境的胁迫，极大地限制了水稻的产量[2-3]。在生产过程中，人们往往通过施用化肥、农药等措施来促进水稻生长，提高水稻产量。但过度使用化肥和农药会给环境带来巨大压力，不利于农业的可持续发展。印度梨形孢Piriformospora indica（Pi）是Verma等[4]从印度塔尔沙漠分离的一种根部内生真菌，其可定殖于多种植物的根系中，促进植物的生长和发育，增强植物对胁迫的抵抗力，提高作物产量[5-6]。【前人研究进展】已有研究表明，印度梨形孢不仅能促进小白菜和拟南芥的生长发育[7-8];提高大白菜、芝麻等作物的抗旱性[9-11]，大麦对高盐的耐受性[12];增加番茄和玉米的生长发育及抵抗力[13-14];还可以提高移栽苗的成活率[15-16];促进药用植物代谢物的产生[17-20]。【本研究切入点】印度梨形孢与丛枝菌根真菌作用相似，不同的是该菌可以在体外培养。目前，印度梨形孢在PDA等培养基上的生长速率还不够快，产生的孢子量不够多，若要获得一定量的孢子，需要更多的培养基和培养时间，也不利于生物菌肥的规模化生产。进一步筛选出适合印度梨形孢生长的培养基，不仅能够加快印度梨形孢的生长速率，更快地获得科研所需的孢子量，节省科研时间，还能加快印度梨形孢生物菌肥规模化生产的进程。【拟解决的关键问题】本研究通过筛选出印度梨形孢的最适培养基，快速获取所需孢子量，让印度梨形孢定殖于水稻根系，促进水稻的生长发育，增强水稻的抵抗力，减少农药和化肥的使用量，减轻对环境的压力，从而促进农业的可持续发展。

1 材料与方法

1.1 供试材料

印度梨形孢菌株及供试水稻品种日本晴，均由长江大学生命科学学院提供。8种供试培养基配方如下：（1）

Aspergillus：参照文献[21];（2）

PDA：200 g·L-1马铃薯+20 g·L-1葡萄糖+20 g·L-1琼脂;（3）

V8：200 mL·L-1 V8果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1琼脂;（4）

农夫果园橙子：200 mL·L-1农夫果园橙子果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1琼脂;（5）

农夫果园芒果：200 mL·L-1农夫果园芒果果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1琼脂;（6）

农夫果园番茄：200 mL·L-1农夫果园番茄果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1琼脂;（7）

MS：50 mL·L-1大量元素+5 mL·L-1微量元素+5 mL·L-1铁盐+5 mL·L-1有机成分，具体配方参照文獻[22];（8）康乃馨：200 g·L-1康乃馨叶片+20 g·L-1琼脂。

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢在平板上的生长速率测定

取-80℃冰箱保存的印度梨形孢菌块接种于PDA平板上，28℃培养箱中培养1周，再转接至新的PDA平板上培养1周左右，在活化的印度梨形孢菌落边缘，用打孔器打成直径5 mm的菌饼，将菌饼分别接种至含不同固体培养基的平板中央，每种培养基接种3个平板，放置于28℃培养箱中黑暗培养，测量并记录印度梨形孢在培养第5、7、10 d时的菌落直径。

1.2.2 印度梨形孢在液体培养基中的生长速率测定

将活化后直径5 mm的印度梨形孢菌饼接种于100 mL液体培养基中，然后放置于28℃摇床，200 r·min-1黑暗培养。分别于培养第5、7、10 d时测量印度梨形孢菌体鲜重[23]，烘干后称量并记录菌体干重，每种培养基每次测量3瓶。

1.2.3 水稻幼苗的培养

选取健康饱满的水稻种子，置于70%乙醇中1 min，无菌水洗涤3次，置于2.5%次氯酸钠溶液中消毒10 min，无菌水洗涤3次后，转入2个已灭菌的培养皿中，加入等量的无菌水，置于植物生长室萌发，植物生长室温度为（26±1）℃，光周期为16 h光照/8 h黑暗，待水稻种子萌发长出根后，向其中一个培养皿中加入适量浓度的印度梨形孢菌悬液，另一个培养皿中加入等体积无菌水作对照。

1.2.4 印度梨形孢的定殖检测

印度梨形孢与水稻共培养14 d后，随机选取10株水稻幼苗，用无菌水冲洗根系，再将根系剪成长度为1 cm的小段，置于10% KOH溶液中过夜，然后用无菌水冲洗3次，1% HCl溶液中浸泡5 min，0.05%台盼蓝染色5～8 min，无菌水冲冼6～8次，最后在400倍显微镜下观察是否有印度梨形孢定殖，印度梨形孢定殖后，将2个培养皿中长势相同的水稻幼苗分别种植于含无菌土壤的2个育苗盒中，观察并记录水稻幼苗生长情况。

1.2.5 水稻生物量及叶绿素含量的测定

接種印度梨形孢20 d后，分别各取10株处理和对照的水稻幼苗，测量株高、最大叶长、最大叶宽、根长、根数、地上地下部鲜重及叶绿素含量，叶绿素含量测定方法参照文献[24]。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢在固体培养基上的生长速率

将印度梨形孢接种至8种固体培养基上培养，发现其在V8培养基上生长最快，培养5 d后，已接近长满整个平板（图1）;其次是3种农夫果园培养基，培养7 d后菌丝体也长满整个平板;再次是PDA培养基和Aspergillus培养基;在康乃馨培养基上生长最慢，生长至10 d时直径只有5.19 cm（表1）。

2.2 印度梨形孢在液体培养基中的生长速率

印度梨形孢在不同的液体培养基中的形态和生长速率各不相同（图2）。本研究发现印度梨形孢在V8培养液中的生长速率最快（表3）。当印度梨形孢在8种培养液中培养5 d时，其在V8培养基中的生物量最大，且印度梨形孢已达到平台期，当培养至7 d和10 d时，进入衰亡期，鲜重随着时间的推移逐渐减少;其次是Aspergillus培养基，当印度梨形孢在Aspergillus液体培养基中生长5 d和7 d时，其生物量都要比在PDA培养基中的生物量要大一些，生长速率相对较快（表2）;生长速率差异最大的为3种农夫果园培养基，和在固体培养基上不同，印度梨形孢在3种农夫果园培养液中的生长速率都没有比在Aspergillus和PDA培养液中的快;生长最慢的仍然是在康乃馨培养基中。2.3 不同碳源对印度梨形孢生长的影响

为了测试不同碳源对印度梨形孢生长的影响，向V8培养基中分别加入浓度为1%的葡萄糖、果糖和蔗糖。研究发现，培养至3、5、7 d时，印度梨形孢在加入蔗糖的V8培养基上的生长速率都是最快的，并在培养至第7 d时，已接近长满整个平板（图3）;而加入葡萄糖或果糖都会稍微抑制印度梨形孢的生长，其生长速率都比在不加糖的V8培养基上慢一点;研究还发现，印度梨形孢在加葡萄糖或果糖的V8培养基上的生长速率没有显著性差异（表3）。

2.4 印度梨形孢的定殖检测

印度梨形孢与水稻幼苗共培养14 d后，取水稻幼苗根系进行台盼蓝染色，在显微镜下可观察到印度梨形孢的孢子存在于水稻根系成熟区的细胞内或细胞间（图4），表明印度梨形孢已成功定殖到水稻根系中。

2.5 印度梨形孢对水稻幼苗生长的影响

印度梨形孢对供试水稻日本晴幼苗的生长有显著的影响。在接种印度梨形孢前，幼苗的生物学性状之间没有显著性差异（图5-A）;印度梨形孢与水稻幼苗共培养7 d后，接种了印度梨形孢的水稻幼苗株高要显著高于未接种印度梨形孢的幼苗株高，而且叶片颜色更绿（图5-B）;接种印度梨形孢20 d后，接种了印度梨形孢的水稻的主根更长，根毛较多，株高更高，叶片更长，鲜重更重，叶绿素含量更多（表4），且处理组的叶片数大多为3叶或2叶1心，而对照组大多为2叶（图5-C）。

3 讨论与结论

本研究表明，在8种培养基中，V8培养基是印度梨形孢的最适培养基，无论是在固体还是液体培养基中，印度梨形孢在V8培养基中的生长速率都是最快的。在固体平板上，印度梨形孢在3种农夫果园培养基上的菌丝生长速率比在Aspergillus和PDA平板上快，而在液体培养基中却相反，这是印度梨形孢在平板上的菌丝体总量增长速度不同所导致的[25]。虽然相同时间内印度梨形孢在3种农夫果园培养基上的生长直径更大，但其菌丝体相对稀疏，菌丝体含量增长速率比在Aspergillus和PDA平板上要慢很多，所以才会在液体培养基中出现相反的结果。研究还发现，平板上培养5 d时，印度梨形孢在Aspergillus培养基上的生长速率比在PDA上的快一些，这与Pham等[25]的研究结果相同，但在培养至7 d和10 d时，生长速率却又相反;液体培养时又发现，不论是培养至5 d、7 d或10 d，印度梨形孢在Aspergillus培养液中的菌丝量都比在PDA中的要多。Pham等[25]研究发现，印度梨形孢在Aspergillus固体平板上培养时，会出现一定规律的停滞生长现象，每当停滞生长时，会产生大量不同直径的孢子，然后再继续生长，这可能是导致印度梨形孢在培养至7 d和10 d时，其在Aspergillus平板上的直径比在PDA上的小的原因;而在液体中培养时，印度梨形孢不出现停滞生长现象，所以印度梨形孢在Aspergillus液体培养基中的菌丝体含量总是比在PDA培养液中的多。向V8培养基中加入不同碳源，发现加入蔗糖能促进印度梨形孢的生长，但加入葡萄糖或果糖都会对印度梨形孢的生长有所抑制，其机制还不明确，有待进一步研究。

已有研究表明，印度梨形孢能够促进小白菜、油菜及芝麻等多种植物的生长[4-8]。本研究表明，印度梨形孢同样能促进水稻的生长发育。与对照相比，定殖了印度梨形孢的水稻具有更好的性状，如株高、叶长、根长、根数、鲜重和叶片叶绿素含量等，差异达显著或极显著水平;与对照相比，接种印度梨形孢20 d后的水稻，其株高增加了32.36%，叶绿素含量提高了15.88%。这些结果表明，印度梨形孢是通过增加光合作用和增强根系生理机能，从而促进水稻的生长发育。这与印度梨形孢提高油菜和芝麻等作物生长的机理类似。

作物在生产过程中会受到各种生物和非生物胁迫，极大限制了作物的产量。通过筛选出更适合印度梨形孢生长的培养基，不仅可以加速印度梨形孢生物菌肥的规模化生产，用该生物菌肥促进作物的生长，提高作物对生物和非生物胁迫的抵抗能力，还能减少农药和化肥的使用量，促进农业的可持续发展。

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（责任编辑：林海清）