HPLC法测定叶黄素葡萄籽软胶囊中叶黄素的含量

郑海云　 赵海誉　 翟永松

摘要：目的：建立叶黄素葡萄籽软胶囊中叶黄素含量测定的高效液相色谱法。方法：参考GB5009.248方法，结合实验结果，确定了本产品的色谱条件。以甲醇-甲基叔丁基醚为流动相，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，柱温 25℃，经由 YMC Carotenoid 色谱柱分离，采用高效液相色谱-光电二极管阵列检测器在 445nm 下进行检测，以峰面积外标法定量。结果：加标回收率实验中，三个添加水平下，叶黄素的平均回收率在93.6%-104.7%之间，RSD为1.26%-2.25%。方法检出限为0.03g/100g，定量限为0.10g/100g。结论：该方法简便易行，稳定性好，是检测叶黄素葡萄籽软胶囊中叶黄素的有效定量方法。

关键词：叶黄素葡萄籽软胶囊;叶黄素;含量测定;高效液相色谱法

【中图分类号】R969.4     【文献标识码】A       【文章编号】1004-7484（2019）10-0070-03

Determination of Lutein in Yehuangsuputaozi Softgel by HPLC

ZHENG Hai-yun1，ZHAO Hai-yu2，ZHAI Yong-song3，GONG Wei-hong4 （1.Collaborating Center for TCM and Scientific Technology，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3.Beijing Pharmaceutical Education Training Center， Beijing 100079， China ;4.School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China.）

【Abstract】 Objective To establish the determination of lutein in Yehuangsuputaozi Softgel by HPLC.Methods Consulting GB 500.9.248 and experiments，using methanol-methyl tert-butyl ether as mobile phase，gradient elution，flow rate was 1.0mL/min，column temperature was 25℃，separated by YMC Carotenoid column，detected by HPLC with photo-diode array detector （PDA） at 445 nm，and quantified by the external standard method. Results At different spiked levels，the average recoveries of lutein were between 93.6%-104.7%，with the RSDs of 1.26%-2.25%.Limit of detection and limit of quantitation were 0.03g/100g，0.10g/100g， respectively.Conclusion The method is simple， rapid and accurate， which can be applied to the analysis of the content of lutein in Yehuangsuputaozi Softgel.

【Key words】Yehuangsuputaozi Softgel;Lutein;Determination;HPLC

葉黄素提取自万寿菊中，是存在于视网膜黄斑处的主要色素，有抗氧化和过滤蓝光的作用[1]。越来越多流行病学和临床试验表明，膳食或血清中较高含量的叶黄素可降低眼部疾病患病风险[2]。作为生理活性物质，叶黄素在医学和功能食品领域具有广阔的研究开发前景[3]。叶黄素葡萄籽软胶囊主要由叶黄素、葡萄籽提取物、维生素E等成分组成的复方制剂，主要用于缓解视疲劳，具有一定的改善视力的作用，适用于视力易疲劳者。本文研究了本产品中有效成分叶黄素的含量测定方法。结合本产品的配方、制备工艺等特点，参考GB 5009.248食品中叶黄素的测定[4]及实验结果制定了本产品中叶黄素的高效液相含量测定方法，完善产品的技术要求，保证产品的质量可控。

1 仪器与试剂

1.1仪器：Waters Alliance e2695高效液相色谱仪，附二极管阵列检测器（美国waters公司）;BP-211D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）;UV-2800H型紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）;CH-300型超声波清洗机（北京创新德超超声电子研究所）

1.2样品与试剂：叶黄素对照品（纯度≥95%，来源于万寿菊，美国 ChromaDex 公司）;叶黄素葡萄籽软胶囊（由北京福寿堂生物科技发展有限公司提供）;丙酮、甲醇、甲基叔丁基醚、二氯甲烷为色谱纯，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：YMC Carotenoid 4.6*250mm，5μm;柱温：25℃;流动相：甲醇-甲基叔丁基醚，梯度洗脱，梯度条件见表1;流速：1.0mL/min;进样体积：10μL;检测器：二极管阵列检测器;检测波长：445nm。

2.2试液的配制

2.2.1 0.1%丙酮：称取2.0gBHT于2000mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度。

2.2.2對照品储备溶液：称取叶黄素对照品150mg于100mL棕色容量瓶中，二氯甲烷溶解并定容至刻度，其浓度约为1.5mg/mL。该溶液避光于-80℃下保存，六个月内使用。使用前需校正。

2.2.3供试品溶液：取本品10粒，取出内容物混匀，精确称取样品0.3g于100mL棕色容量瓶中，加0.1%BHT丙酮超声提取15min，冷却至室温后，定容至刻度，摇匀。准确吸取1.00mL该溶液于10mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT丙酮稀释至刻度。摇匀，经0.45μm滤膜过滤，进样。

2.2.4阴性样品溶液：取不含叶黄素的阴性样品，按照“2.2.3”项下方法制备得阴性样品溶液。

2.3标准溶液的校正：吸取标准储备溶液2.50mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，作为标准中间溶液。该溶液避光于-80℃下保存。精密吸取1.00mL标准中间溶液至25mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度。以乙醇作空白，在445nm处测定吸光度A。按公式计算储备液中叶黄素的浓度（mg/mL）。式中A为样品测得的吸光度;2550为叶黄素在乙醇溶液中的百分吸光系数。经校正后其储备液浓度为1.352mg/mL。

2.4专属性实验：按照“2.1”项下色谱条件，分别记录取阴性样品溶液、对照品溶液、供试品溶液，见图1、2、3。结果显示，对照品色谱图中，叶黄素的出峰时间合适，峰形良好附近，供试品色谱图中叶黄素峰分离良好，无杂峰干扰，阴性样品色谱图中叶黄素保留时间处无色谱峰出现，表明阴性样品对叶黄素测定无干扰，符合专属性要求。

2.5线性关系考察：分别准确吸取标准中间溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL于10mL棕色容量瓶中，用0.1%丙酮稀释成工作溶液，其浓度分别为：0.8450μg/mL、1.690μg/mL、3.380μg/mL、8.450μg/mL、16.90μg/mL、33.80μg/mL。以标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，以峰面积响应值为纵坐标，绘制曲线方程。曲线方程Y=74613X-3.8093，r=0.9995。叶黄素在0.8450μg/mL-33.80μg/mL浓度范围内，线性良好。

2.6精密度试验：称取6份样品（批号20171107），按照“2.2.3”项下样品前处理操作，并按“2.1”项下色谱条件测定，测试方法精密度，结果见表2。本方法精密度良好。

2.7准确度试验：取样品（批号为20171107），各称取3份样品，分别加入浓度为1.352mg/mL对照品储备液6mL、7mL和8mL，按法操作，按照低、中、高3个加标水平下的标准添加，按照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果显示，三个添加浓度水平下，叶黄素的平均回收率在93.6%-104.7%之间，相对标准偏差为 1.26%-2.25%。结果见表3。本方法准确度良好。

2.8方法检测限和定量限：当取样量为0.3g，定容体积为100mL，稀释倍数为10倍时，按3倍信噪比计算，该方法叶黄素的检测限为0.03g/100g，定量限为0.10g/100g。

2.9样品的含量测定：取三批叶黄素葡萄籽软胶囊，按照“2.2.3”项下样品的处理方法操作，并“2.1”项下色谱条件测定，结果见表4。

3 讨论

本测定方法主要参考GB5009.248进行，结合自身产品的属性，改进了提取方法及测定条件。

3.1样品前处理的考察：本产品中添加的叶黄素原料为游离状态，未进行包埋，因此容易提取出来。叶黄素对光非常敏感，因此本产品采用避光超声方法进行提取。对同一样品分别用丙酮及 0.1% BHT 丙酮为提取溶剂，测定提取后的叶黄素含量，提取溶剂中加入了BHT叶黄素的稳定性更好[5]，故选择以 0.1% BHT 丙酮为提取溶剂。分别考察超声 10，15，20 min 叶黄素的提取效果，结果显示，超声15min和20min差异不大，均优于超声10min，故选择超声时间为15min。

3.2色谱条件的优化：按照GB5009.248的色谱条件，在高效液相中进样，色谱图中峰的分离度不好，经过多次摸索和改进，确定了以甲醇-甲基叔丁基醚为流动相，梯度洗脱，洗脱条件详见表1的色谱条件。

4 结论

参考GB5009.248，结合产品自身性质，我们建立了叶黄素葡萄籽软胶囊中叶黄素的测定方法。根据实验结果，此方法专属性、准确度、精密度、线性、方法检测限和定量限均符合相关要求，是检测叶黄素软胶囊中叶黄素的有效定量方法。

参考文献

[1] Kijlstra A，Tian Y，Kelly E R，et al.Lutien：More than just a filter for blue light[J].Progress in Retinal and Eye Rearch，2012，31（4）：303-315.

[2]李大婧，庞慧丽，刘春泉.叶黄素和玉米黄质对眼睛的保护作用研究进展[J].江苏农业科学，2013，41（9）：1-4.

[3]李大婧，刘春泉，白云峰，等.叶黄素、玉米黄质研究进展：叶黄素、玉米黄质的结构、性质和生物学功能[J].核农学报，2006，20（1）：64-67.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品中叶黄素的测定：GB 5009.248-2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]鲁杰，方从荣，高洁，等.微胶囊化功能性番茄红素产品的高效液相色谱测定法改进[J].中国食品添加剂，2013（3）：99-102.

课题：重大新药创制科技重大专项 2019ZX09201-005-006-002