LC-MS/MS法测定毛曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱的含量

陈 静 ，张 凤 ，张 锐 ，李 卿 ，范惠珍

（1.宜春学院化学与生物工程学院，江西，宜春 336000； 2.第二军医大学长征医院药材科，上海 20003）

曼陀罗亦称“风茄儿”，为茄科曼陀罗属，一年生草本植物。它是一种历史悠久的药用植物，分布广泛，可用于治疗关节痛、哮喘、咳嗽、胃肠痉挛、神经性偏头痛、止痛、痛风、烫伤、溃疡、狂躁、癫痫症、抑郁症、风湿症、抽搐、跌打损伤等症。生物碱莨菪烷类是曼陀罗中的主要化学成分。也是其主要的毒性以及活性成分[1]，并且活性比较高。其中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱等生物碱具有解痉阵痛、止咳平喘、麻醉镇静的功效[2]，并可用于缓解内脏绞痛[3]，但对人有剧毒，中毒多见于儿童误食曼陀罗、莨菪等植物的花果所致[4]。曼陀罗中毒的主要表现有口渴舌燥、发音嘶哑、颜面潮红、头晕恶心、呕吐、烦躁不安、语无伦次、瞳孔散大、视物模糊、抽搐痉挛等[5]症状。

曼陀罗具有多种生物活性，可广泛应用于医学、农林业中。随着对其药理作用的不断研究，发现其诸多的药用价值，让莨菪碱更广泛地在临床上与医学上应用，也让其需求量迅速地增长[2]。已经有研究利用曼陀罗毛状根部生产生物碱的报道[6]，曼陀罗成分复杂繁多，使用传统的方法 TLC、HPLC、GC-MS等把莨菪碱类完全分离是非常困难的。本研究建立LC-MS/MS方法对曼陀罗中的莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱的含量进行测定，研究结果显示，该方法简便，灵敏度、重复性好，用时较短，可用于其含量的测定，值得进一步推广。

1 实验材料

1.1 仪器

安捷伦1200液相色谱-G6410A三重四级杆串联质谱联用仪（Agilent，美国），包含G1311A输液泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，DAD检测器，G1314BVWD检测器，MassHunter软件控制系统及数据处理工作站（Agilent，美国）；labnet定时可调速旋涡混合器（labnet，美国）；超声仪（SK7200H型，上海科导超声仪器有限公司）；Eppendorf移液器（100、200、1000 μL，德国）；容量瓶。

1.2 药材及试剂

标准品：莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱、华法林（上海锐生物科技有限公司）纯度98%）。

待测物：曼陀罗的毛状根部（12个不同批次）（上海长征医院药材科李卿副教授提供），甲醇（Merck，德国）、甲酸（Merck，德国）、乙腈（Merck，德国）、水（屈臣氏）、盐酸（上海裕纳有限公司）、浓氨水（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子；毛细管电压：4000 V；截取锥电压：60 V；气体温度 ：350 ℃；气体流速：10 L/min。待测物以及内标华法林的MRM模式参数如表1。

表1 质谱条件Table 1 The conditions of mass spectrometry

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm），流动相：乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32；柱温：25 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：2 μL；单针时间：3 min

2.3 供试品溶液的制备

精密称取50 mg用蒸馏水冲洗干净并且用滤纸吸去多余水分，50℃烘至恒重的毛状根样品，研磨成干粉；加入10 mL盐酸，超声30 min，冷却、过滤，再用10 mL盐酸分三次洗涤滤渣；与上述过滤液合并，用浓氨水调节pH=9，超声45 min；再加6 mL三氯甲烷，充分振荡；冷冻干燥（20 ℃，2000 rmp）残留物溶于2 mL三氯甲烷中（有黄色不容物，超声3 min）12000 rpm离心5 min，吸取上清液20 μL用甲醇稀释10倍，备用。

2.4 对照品溶液的制备

2.4.1 标准品母液的配制

分别精密称取莨菪碱 0.9 mg、东莨菪碱0.64 mg、山莨菪碱0.88 mg，用甲醇定容至2 mL，作为标准品母液，备用。

2.4.2 线性溶液的配制

将标准品莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱母液用甲醇稀释成浓度分别1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000的混标溶液，备用。

2.4.3 内标的配制

精密取适量标准品华法林用甲醇溶解配制成10 ng/mL，备用。

2.5 线性关系的建立

按照上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定，对 2.4.2下的浓度梯度进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)绘制标准曲线。结果显示，各成分在各自范围内线性关系良好，莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的线性回归方程分别是 Y=813.8904X+2165.3000（R2=0.9922）、Y=714.1221X+517.4311（R2=0.9892）、Y=872.9971X+1024.4247（R2=0.9952），分别在 1～200、1～1000、1～1000 ng/mL范围内线性关系良好。

2.6 专属性的实验

取适量供试品、对照品、阴性对照溶液各1份，按上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定。在同一检测条件下，阴性对照无明显干扰，对照品与供试品在相同的出峰时间分别出现了莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱色谱峰，出峰时间均在1 min左右，用时比较短，分离度高。各成分的色谱图如图1、图2、图3：

图1 样本的色谱图Fig.1 Chromatogram map of the sample

图2 混标的色谱图Fig.2 Chromatogram map of the scopolamine

图3 为阴性对照色谱图Fig.3 Chromatogram map of blank

2.7 回收率实验

精密称取6份相同量的供试品，分别加入相同量的对照品，按上述2.3的方法制备供试品，按照2.1与2.2的测定条件下进行测定，记录各待测成分的峰面积。实验的结果表明，6份供试品中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的平均加样回收率分别为：97.17%；97.20%；92.68%；RSD 分别为 1.02%、1.31%、1.41%。RSD≤2，说明样本的处理过程影响小，测定方法的准确度高，结果见表2。

表2 三种成分加样回收率的测定结果Table 2 The results 0f 3 samples recovery test

2.8 重复性实验

同一环境下，同一个操作人员，取6份供试品，分别加入相同量的对照品，按上述 2.1.1的方法制备供试品，在上述2.2与2.3的色谱条件下进行测定，记录各待测成分的峰面积。一份供试品连续进样6次，分别记录供试品莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的峰面积。RSD分别为1.38%、1.31%、1.21%。说明该实验方法的重复性比较好。

2.9 稳定性实验

相同条件下，同一个操作人员，取同一份供试品，按上述2.1.1方法制备供试品溶液，在上述2.2与2.3的色谱条件下进行测定，在0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，结果表明供试品中的3种成分性质在24 h内性质稳定，RSD≤2，说明该方法对24 h内的供试品测定是稳定的，结果如表3。

表3 稳定性实验的结果（ng/mL）Table 3 The results of stability experiments

2.10 样本测定的结果

采用上述建立的 LC-MS含量测定方法，测定12份不用批次的供试品毛曼陀罗中三种成份的含量，按照上述2.3方法进行处理，在上述2.1与2.2的色谱条件下进行测定，每份供试品重复进样3次，其平均值作为曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱的含量，结果见表4。

表4 曼陀罗中3种成分的浓度分别为（ng/mL）Table 4 The contents of various compounds in 3 mandola

3 讨论

曼陀罗中莨菪碱含量的测定方法目前有酸碱滴定法[8]、反相离子对液相色谱法(GC-MS)[9]、高效相色谱法(HPLC)[10]和气相色谱-质谱法(GC-MS)[11]等。近年来，医疗行业主要采用高效液相色谱法(HPLC)测定曼陀中莨菪碱的含量，但是此方法的灵敏度比较差[7]，对流动相的要求比较繁琐[12]。本研究建立 LC-MS/MS方法用于测定曼陀罗毛根部莨菪碱的含量，该方法不仅灵敏度好，流动相仅是采用等度的乙腈-(0.05%甲酸)水溶液=68:32，出峰时间短，实验用时较少，操作简单，并且灵敏度高。

莨菪碱类为典型的生物碱类，按传统的生物碱的提取方法，色谱图出现杂峰较多且分离度不好。本实验采用了酸提取，提取回收率比较高，由于酸提取后过滤困难，因此本实验又分别试了甲醇和三氯甲烷，再进行提取过滤，结果三氯甲烷提取回收率高于甲醇，故选择三氯甲烷作为再提取过滤的溶媒。本试验采用盐酸、浓氨水、三氯甲烷的萃取方法进行提取，不仅提取回收率高，色谱图也比较简单，该方法适合用于曼陀罗中生物碱的提取与分离。

本实验采用的是色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,3.5 μm)，对酸性、碱性化合物都表现出很好的分离性能，且分离度比较高。采用此色谱柱不仅出峰时间比较早且峰型好，没有出现拖尾及裂峰等现象。由于上述样本处理中采用了甲醇对样本进行稀释，为了避免溶剂效应，标准品以及内标均采用甲醇进行溶解。

本研究建立的LC-MS/MS的方法能够很好的将曼陀罗中的莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱提取与分离，此方法操作简单且重复性好，回收率高，可以用于曼陀罗中莨菪碱、东莨菪碱和山莨菪碱含量的测定。