4 株猪流行性腹泻病毒的HA 和HI 试验

郭恒科，谭 鑫，库旭钢，范盛先，何启盖，孟宪荣

（华中农业大学动物医学院，农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是冠状病毒科成员，由其引起的猪流行性腹泻（PED）是一种以急性水样腹泻和脱水为特征的肠道疾病[1]。PED在多个国家呈地方性和季节性暴发，导致新生仔猪死亡以及育肥猪体重减轻，给养猪业造成了严重经济损失[2]。使用疫苗免疫是预防本病的最主要措施，但目前尚缺乏有效的免疫效果评估方法。现行的PEDV 抗体检测方法，如间接免疫荧光和中和试验等大都过程复杂，不适合临床使用。传统的间接血凝试验（HA）操作简单且经济实用，是疾病诊断的经典方法之一，已被广泛用于具有这种特性病毒的定性和定量分析，包括正黏病毒、副黏病毒和脑心肌炎病毒等[3-4]。另外，如果存在抗病毒抗体时，由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以间接血凝抑制试验（HI）可用于抗病毒抗体的检测。

同属冠状病毒，如猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），可凝集牛红细胞，而PEDV 在自然状态下不具有血凝活性[2]。2010 年，韩国学者发现，将PEDV 细胞适应株（KPEDV-9 和SM98LVec）经胰蛋白酶或神经氨酸酶处理之后，可以凝集兔的红细胞而表现出血凝特性[3]。

本试验通过确定PEDV 的HA 活性特点，为建立HA 和HI 试验方法，评估疫苗免疫猪的抗体水平奠定基础。

1 材料和方法

1 .1 材料

1.1.1 病毒株 YN13 株（GenBank accession No.KF761675）及传代致弱的YN144 株：由本实验室分离保存；CV777 株（GenBank accession No.AF353511）：由天邦生物制品有限公司（ 成 都） 惠 赠；DR13 株（Genbank accession No.JQ023162.1）：由本实验室从弱毒疫苗中分离得到。所有病毒株均经VERO 细胞培养，测定TCID50后，-80 ℃保存。

1.1.2 红细胞 鸡、兔和猪红细胞：来自于健康动物。

1.1.3 血清和乳清 PEDV 抗体阴、阳性血清和乳清：来自疫苗免疫后猪，并经IFA 和ELISA 试验检测鉴定；猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒抗体阳性参考血清：由华中农业大学动物医学院传染病实验室鉴定并保存。

1.1.4 耗材和试剂 96 孔V 型板、抗凝管：山东奥赛特医疗器械有限公司产品；胰蛋白酶：Sigma公司产品；25%戊二醛：国药集团产品；配制0.01 mol/L PBS 的化学试剂：均为国产分析纯。

2 方法

2.1 红细胞制备和醛化

参考《兽医免疫学实验指导》[5]中的方法，制备4%的动物红细胞。将4%的红细胞用PBS配制成1%的细胞悬液，再在4 体积的悬液中加入1 体积的2.5% 戊二醛溶液（即40 mL 1% 的红细胞悬液加上10 mL 的戊二醛溶液，需边搅拌边缓慢加入），放在磁力搅拌器上搅拌45 min。搅拌完成后，用PBS 洗涤醛化后的红细胞，然后3 000 r/min 离心5 min，共4 次。最后再用PBS（pH7.1）将其配成1%的醛化红细胞悬液[6-7]。将醛化红细胞放在4 ℃冰箱中备用。

2.2 HA 和HI 试验

先将CV777、DR13、YN14 和YN144 等PEDV 毒株在37 ℃下，用5 μg/mL 的胰蛋白酶作用30 min。再参考《兽医免疫学实验指导》[5]中的HA 试验步骤进行操作和结果判定。将病毒用含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 连续2 倍稀释，对病毒和红细胞37 ℃作用15 min，每个病毒设置4 个重复。

根据HA 试验得到的病毒血凝价，将其配制成4 单位（4 U）抗原。参考《兽医免疫学实验指导》中HI 试验步骤进行操作和结果判定，其中病毒和血清（乳清）的作用时间为室温1 h，红细胞震荡混匀后37 ℃作用15 min，设置4 个重复。

2.3 红细胞种类和胰蛋白酶对HA 试验的影响

分别用制备好的醛化兔、鸡和猪红细胞与经过胰蛋白酶处理的PEDV 病毒液做HA 试验。确定红细胞种类后，再分析胰蛋白酶浓度对PEDV HA试 验 的 影 响。 先 将CV777、DR13、YN13和YN144，37 ℃下分别用0、5、10、50、100 μg/ mL 胰蛋白酶（Sigma）处理30 min，然后用含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS 连续2倍稀释，参考2.2 完成HA 试验。每个胰蛋白酶浓度处理的病毒做4 个重复。

2.4 HI 试验的特异性检验

分别用猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒和PEDV 阳性参考血清，做PEDV HI 试验。

3 结果

3.1 红细胞种类和胰蛋白酶对HA 试验的影响

用胰蛋白酶处理4 株PEDV 毒株后发现，PEDV 对兔源红细胞表现出HA 活性，对猪源和鸡源红细胞没有表现出HA 活性（表1）。不同浓度的胰蛋白酶处理病毒结果显示，用5 μg/ mL或以上浓度的胰蛋白酶处理，CV777 和DR13 毒株在37 ℃下，对兔红细胞表现出HA 活性，并且胰酶浓度越高，表现越明显，YN13 和YN144 株不需要经过胰酶处理，就可以使1%兔红细胞发生凝集（图1）。

表1 红细胞种类对PEDV HA 试验的影响

3.2 HI 试验及其特异性

将YN13 株配制成4 单位（4 U）抗原，用PEDV 抗体阳性血清进行HI 试验（2 个重复），结果如图2，表明PEDV 的HA 活性能够被特异性抗体所抑制。PEDV 抗体阳性乳清HI 特异性试验结果见图3，样品的HI 效价见表2；HI 特异性试验结果（图4）显示，只有PEDV 抗体阳性组出现血凝抑制，其他常见猪病病原的抗体阳性血清组都出现了血凝现象，证明其特异性较高。

A. DR13；B. YN13；C. CV777；D. YN144；E. 空白对照。图1 不同浓度胰蛋白酶处理的PEDV HA 试验结果

图2 血清样品的HI 试验结果

图3 乳清样品的HI 试验结果

图4 PEDV HI 特异性试验结果

4 讨论

HA 是许多病毒共有的可广泛用于临床诊断的血清学特性。冠状病毒科成员在凝集红细胞能力方面存在较大差异，一些冠状病毒仅在特殊条件下才会与相应的靶红细胞发生凝集。部分冠状病毒表面有HE 蛋白，其与C 型流感病毒的血凝素蛋白有结构和功能上的关系，并且可能是通过C 型流感病毒的HE mRNA 与冠状病毒的基因组RNA 重组衍生而来的[8-9]。戊型肝炎病毒（HEV）在室温下容易凝集鸡红细胞。对于鼠肝炎病毒（MHV）来说，虽然有几种毒株含有HE 糖蛋白，但是仅有MHV—幼鼠腹泻病毒（DVIM）可引起血凝[12]。而传染性支气管炎病毒（IBV）需经胰蛋白酶、磷脂酶C和神经氨酸酶等处理后才表现HA 活性[13]。TGEV可以凝集鸡源、豚鼠源和牛源红细胞，在4 ℃时不凝集小鼠和鹅的红细胞[3，10]。PEDV 的HA 活性需要胰蛋白酶处理后诱导[3，10-11]，这可能与其可促进细胞与病毒之间膜融合的S2 蛋白结构有关[14-16]。此外，具有重要生物学功能的S 蛋白，在宿主体内主要介导中和抗体的产生[17]。

表2 阳性样品的HI 效价

本试验探索了4 种PEDV 株HA 活性特征，发现4 种毒株都能够凝集兔红细胞，但不能凝集鸡源和猪源红细胞。此外，CV777 和DR13 毒株的HA 活性与TGEV 和IBV 的HA 活性相类似，都是由胰蛋白酶的蛋白水解而引发的，这与韩国学者的研究结果一致[3]。本试验发现，YN 株及其弱毒YN144 株不需要经过胰蛋白酶处理就具有HA 活性，说明PEDV 的HA 活性具有毒株特异性。

HI 试验结果表明，PEDV 的血凝抑制试验特异性较高。PEDV 在经过胰蛋白酶处理后与兔红细胞有血凝现象，并且能被血清或者乳汁中的特异性抗体所抑制，据此可以建立PEDV 的HA/HI 诊断方法。研究发现，PEDV YN13 株和其致弱毒株YN144 的血凝想现象不受胰蛋白酶影响，说明HA能力与PEDV 毒力无关。另外，用YN144 株作为弱毒疫苗使用时，可以用HA 试验做鉴别诊断。