荧光原位杂交在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测中的应用

孙明军，王 萍，张喜悦，孙翔翔，孙世雄，魏 荣

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；

2.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266100）

荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是20 世纪80 年代末发展起来的一种原位杂交技术，已被广泛应用于动植物基因组结构和癌症基因检测以及致病性微生物诊断等许多领域[1-3]。FISH 原理是，用荧光素标记的已知单链核酸为探针，依照碱基互补的原则，使其与待检材料中未知的单链核酸进行杂交，通过荧光显微镜观察杂交信号，来显示目标片段的丰度和位置。由于具有操作简便、快速、特异性高等特点，荧光原位杂交已成为细菌研究领域强有力的工具[4]。

病原分离鉴定是传染病确诊的金标方法。但对于布鲁氏菌病和牛结核病（简称“两病”）这两个危害严重的人兽共患病来说，病原分离鉴定需要高等级生物安全防护设施，而且分离培养过程复杂而漫长，这制约了“两病”的及时诊断。而荧光原位杂交技术经样品固定后可以灭活病原，因而杜绝了后续操作过程中人员感染的风险，可在生物安全二级实验室完成检测，比传统的病原分离鉴定更具优势。目前，“两病”荧光原位杂交诊断技术还没有在国内实验室应用。该方法曾在人布鲁氏菌病诊断上有些尝试[5]，但对分枝杆菌来说，因细胞壁结构特殊，阻碍了其在人和动物结核病诊断上的应用。本研究选取已报道的布鲁氏菌和结核分枝杆菌16s RNA 探针[6-8]，通过改进样品处理方式、优化杂交条件，进一步简化操作步骤，同时利用本实验室保存的菌株和组织样品，对探针的特异性进行评价，最终建立了一个快速、准确的“两病”荧光原位杂交诊断方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 荧光标记DNA 探针 细菌通用探针EUB338（5′-CTG CTGCCT CCC GTA GGA GT-3′），布鲁氏菌探针Bru-996（5'-CCA CTA ACC GCG ACC GGG ATG-3'）和牛结核分枝杆菌探针MTB770（5'-CAC TAT TCA CAC GCG CGT-3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其中EUB338 和MTB770 两端用荧光素FAM 标记，Bru-996 用Cy3 标记。

1.1.2 菌株和病料 本试验使用的菌株以及肺脏、肝脏等组织病料，由人兽共患病监测室保存，其中菌株包括：布鲁氏菌S2、A19、Rev.1 疫苗株，布鲁氏菌HN6、XJ-1 株，牛结核分枝杆菌XJ1306、XJ1307 株，以及禽结核分枝杆菌株、大肠杆菌O:157 株。

1.1.3 仪器设备 荧光显微镜（AxiovertA1，CarlZeiss）； 分 子 杂 交 炉（LF-IIIA， 宁 波 新芝）；激光共聚焦显微镜（FluoViewTMFV1000，Olympus）。

1.1.4 试剂 溶菌酶、消色肽酶：购自Sigma公司；甲酰胺、4%多聚甲醛、鲱鱼精DNA、抗荧光淬灭封片剂、二甲苯等试剂：均由上海生工提供。预杂交液：900 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris（pH7.5）、0.01% SDS、20%甲酰胺、100 ng/mL 鲱鱼精DNA以及终浓度为2 ng/μL 的荧光标记探针；洗涤液：225 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、0.01% SDS、20 mmol/L Tris（pH7.5）。

1.2 方法

1.2.1 样品准备 将冷冻保存的布鲁氏菌株接种于布鲁氏菌液体培养基（BBL），37 ℃培养2 d；牛、禽结核分枝杆菌接种于罗氏培养基，37 ℃培养4 周；回收培养物，PBS 洗一遍，然后加入1%PFA 溶液，混匀，4 ℃冰箱过夜。以上操作须在生物安全三级实验室进行，FPA 固定后的步骤可在生物安全二级实验室进行。

1.2.2 杂交和镜检 将固定后的菌液用PBS 洗两遍，然后涂布于载玻片上，风干待检。对布鲁氏菌，依次在30%、70%、100%乙醇中处理5 min，然后置阴凉处自然风干；加200 μL 杂交液，45 ℃杂交1.5～4 h；用44 ℃预热的洗涤液洗涤20 min，双蒸水冲洗后，滴加抗荧光淬灭封片剂，镜检。对牛结核分枝杆菌，把样品在二甲苯中作用10～20 min后，依次在100%、70%、30%乙醇和PBS 缓冲液中处理5 min，用溶菌酶（1 mg/mL）和消色肽酶（30 U/mL）消化20 min，然后分别在PBS 以及30%、70%、100%乙醇中处理5 min，风干；滴加杂交液，45 ℃杂交4 h，用37 ℃预热的洗涤液洗涤20 min，最后封片镜检。对组织研磨液，短暂离心，取上清，PFA 固定后涂片。对痰液样品，先涂片，再用PFA 固定，杂交过程与上相同。

2 结果与分析

2.1 布鲁氏菌

杂交前，对布鲁氏菌无需特别处理，45 ℃杂交1.5 h 即出现红色荧光信号，200 倍放大下观察，清晰可见（图1-A、B）。杂交3 h 可完全满足检测需要，延长时间至8 h 或12 h，信号强度不会明显增加，因而布鲁氏菌荧光原位杂交简便、快速，可在4 h 内完成。Bru-996 探针与布鲁氏菌S2、A19、Rev.1 疫苗株和HN6、XJ-1 分离株，均产生杂交信号，在牛结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和大肠杆菌中没有观察到荧光信号（表1），表明该探针具有较高的特异性。从5 个已知布鲁氏菌病羊组织病料（2 个肝脏、2 个脾脏、1 个胎盘）中均成功检测到布鲁氏菌（图1-C），证明该方法具有较高的敏感性。在高倍放大下观察，布鲁氏菌呈短杆菌，小于大肠杆菌（图1-D）。

A. S2 疫苗株（Bru-996，20×10）；B. S2 疫苗株（EUB338，20×10）；C. 羊胎盘研磨液（Bru-996，100×10）；D. 大肠杆菌（EUB338，100×10）。图1 布鲁氏菌检测结果

表1 不同种类菌株和探针杂交结果

2.2 牛结核分枝杆菌

牛结核分枝杆菌样品杂交前，须用二甲苯和溶菌酶处理（也可使用消色肽酶，但非必须），二者缺一不可。二甲苯需处理至少20 min，溶菌酶需消化30 min，以充分去除表面的酸类物质，从而获得充分的通透性，便于探针进入并与RNA 杂交。45 ℃杂交4 h，可获得最佳效果，缩短杂交时间会影响信号强度。因此，牛结核分枝杆菌的检测时间较长，需6～8 h。从牛肺脏结核结节研磨液上清中，成功检测到牛分枝杆菌（图2-A），经抗酸染色检出较多的抗酸菌（图2-B）。结核病阳性牛鼻腔拭子中，未检出典型的牛结核分枝杆菌。

A. 牛肺脏结核结节研磨上清杂交结果（MTB770，100×10）；B. 牛肺脏结核结节组织抗酸染色（100×10）；箭头指示为牛结核分枝杆菌。图2 牛结核分枝杆菌荧光原位杂交和抗酸染色比较

3 讨论

利用16s RNA 原位杂交进行细菌鉴定主要基于以下几点：一是16s RNA 序列较为保守，是细菌系统进化和分类的经典方法之一；二是16s RNA在细菌中的丰度较高（5 000～50 000 拷贝），杂交信号强、易于捕捉；三是细菌固定后可以保持原有形态，镜检时可将其形态特征作为判断手段。核酸分析和形态学特征相结合保证了荧光原位杂交方法的特异性，因而可以作为细菌性传染病确诊的依据。

另外，与其他检测方法相比，荧光原位杂交还具有以下优势：

（1）拭子、痰液、组织等样品采集后，立即用FPA 固定，可以灭活病原，排除样品采集、运输、检测过程中的生物安全风险。

（2）传统的病原分离鉴定需要在P3 实验室内进行，而且耗时耗力，而荧光原位杂交可在8 h内完成鉴定，大大提高了工作效率。

（3）传统的real-time PCR方法需要核酸提纯，操作中易导致污染而出现假阳性，而荧光原位杂交可以忽略核酸污染，提高检测的特异性。

（4）在牛结核病诊断上，比抗酸染色方法特异性高，因为抗酸染色无法区分牛结核分枝杆菌和其他非结核分枝杆菌（如副结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和其他环境分枝杆菌）[9-10]，而荧光原位杂交使用的探针对结核分枝杆菌是特异性的，与其他分枝杆菌不会产生杂交信号。

荧光原位杂交在动物布鲁氏菌病和牛结核病诊断应用上还有一些局限。该方法需要昂贵的仪器，而大部分实验室还不具备荧光显微镜和激光共聚焦显微镜，所以不利于普及。由于牛种、羊种、猪种等布鲁氏菌的16s RNA 序列高度保守，设计和筛选种/亚种特异性的探针非常困难，目前只有布鲁氏菌属特异性探针。另外，该技术还不能实现高通量检测，目前仅限于布鲁氏菌病和牛结核病的实验室诊断。

综合来看，荧光原位杂交技术尽管有不足，但在布鲁氏菌病和牛结核病等人兽共患病的检测和研究上仍然具有优势。世界动物卫生组织（OIE）已将16s RNA 检测作为牛结核病诊断的依据，但在布鲁氏菌检测上，该方法的敏感性和特异性还需进一步验证。针对不同布鲁氏菌种属鉴别困难的问题，下一步可以通过筛选其他RNA（包括mRNA）种特异片段来实现。另外，还需要根据布鲁氏菌病和结核病的发病特征，确定最佳检材，并建立实验室检测标准操作程序，以规范和推广该方法。