非洲猪瘟诊断技术研究进展

高 瞻，张光磊，邵军军，常惠芸

（中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，

OIE/国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州 730046）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪的一种急性、烈性、高致死性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1-2]。因ASFV 存活时间长、抵抗力强，以及基因组庞大、易变异[3]，至今仍无商业化疫苗可用，但有多种诊断技术可用于ASF 监测和确诊。本文论述了ASF 的病原学、血清学诊断技术并分析了其优缺点，以便为不同需求的诊断提供相应的技术支持。

1 病原学诊断技术

1.1 病毒分离与检测

1.1.1 病毒分离 ASFV 分离必须在BSL-3 级及以上生物安全实验室中进行。临床样本可采集猪血液或器官组织，需要大量病毒时，可使用已建立的ASFV敏感细胞系，例如猴源的Vero和COS-1细胞，猪源的永生化猪肺泡巨噬细胞（IPAM）和野猪肺细胞（WSL）[4]。

1.1.2 红细胞吸附（haemadsorption，HAD）试验 HAD 是病毒感染巨噬细胞并在其中复制，导致红细胞吸附的一种自然现象，由Hess 等[5]在1969 年首次发现。实验室用采集的发病猪血液或组织悬液，接种猪原代巨噬细胞，每天观察细胞培养物中巨噬细胞表面是否有红细胞附着，若最终呈现玫瑰花环状或桑葚状，判为阳性结果并根据结果对样本的病毒量进行定量[6]。尽管该方法灵敏性高、特异性强，但检测周期长、检出率低。自1968 年西班牙首次发现ASFV 以来，截至1974 年，已分离出200 多株不具备红细胞吸附能力的ASFV 毒株[7]，因此HAD 不再是主要的ASFV 检测方法。

1.2 核酸检测

1.2.1 聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR） PCR 是常用的核酸检测方法，其优点是简单快速、灵敏度高、特异性强，对标本纯度要求低，并已广泛用于ASF 的现场诊断[8]。该技术通常采用基因组高度保守区域vp72为引物，能够鉴定出ASF 参考实验室提供的不同ASFV 基因型分离株的基因组。曾少灵等[9]基于ASFV 结构蛋白基因vp73 序列设计特异性检测引物，比OIE 推荐的引物（ASFV-278F、ASFV-278R）和（ASFV-257F、ASFV-257R）的灵敏度分别高出100 倍和1 000 倍，并且特异性相当。Basto 等[10]建立巢式PCR 用以检测蜱体内ASFV，敏感性高于OIE 推荐的PCR 检测方法。多重PCR 反应原理与一般PCR 相同，而区别在于在同一反应体系中加入了两对以上引物进行扩增，因此具有高效性、系统性、经济简便等优点。Xiao 等[11]设计了7 对特异性引物和探针，并进行了多重PCR、PCR 产物与偶联探针杂交，然后通过Bio-Plex 悬浮阵列系统检测新建立的方法，结果表明该方法具有高度的特异性和重复性，7 种病毒的同时检测限达到103拷贝/μL。Bio-Plex 悬浮阵列是一种快速、特异、高通量的工具，可单独或同时混合检测7 种猪病毒，对于今后开发用于诊断动物疾病的液体芯片技术具有重要意义。

1.2.2 实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR） qPCR 利用荧光信号实时检测，不仅解决了传统PCR 技术需要琼脂糖凝胶电泳判定结果的问题，而且速度快、灵敏度更高，最低检 测 限 为10 拷 贝/μL。Tignon 等[12]基 于ASFV p72 基因建立的方法，其敏感性高于OIE 推荐的常规PCR 和实时荧光定量PCR。曾少灵等[13]基于ASFV vp73 基因保守序列建立的方法，其灵敏度与OIE 推荐的荧光PCR 方法相当，比普通PCR 方法高出至少10 倍，特异性与OIE 推荐的这两种相当。

1.2.3 微滴数字PCR（ddPCR） ddPCR 是第三代PCR 技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的技术。邬旭龙等[14]基于ASFV K205R 基因建立ddPCR 检测技术，最低检测限为0.36 拷贝，在20 μL 反应体系中约为10 拷贝/反应，检测灵敏度是qPCR 的10 倍，并且不与其他猪病阳性血清发生反应，特异性强，具有很好的应用前景。

1.2.4 原位杂交（in situ hybridization，ISH）ISH 是利用标记探针与目的核酸结合后再检测的一种技术方法，不仅能检测出待检核酸，还能在细胞中精确定位。Oura 等[15]建立了针对ASFV 衣壳蛋白vp73 的原位杂交技术，检测效果良好。

1.2.5 环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP 是 日 本Notomi[16]发明的一种敏感性很高的DNA 扩增技术。该技术已成功应用于SARS、禽流感、艾滋病等疾病的检测。Heather 等[17]以ASFV 拓扑异构酶II 基因为靶点建立了LAMP 方法，其灵敏度不低于330 个基因组拷贝数，能够检测到具有代表性的ASFV 分离株（n = 38），且不与经典的猪瘟病毒发生交叉反应。杨吉飞等[18]基于ASFV 结构蛋白vp72 基因建立了LAMP 检测技术，并成功应用于ASF 参考实验室提供的17 个ASFV 毒株的基因组，与猪病的其他病原及传染媒介之间均没有交叉反应，只是LAMP 中引物的相互作用可能会导致假阳性信号[19]。该技术对设备要求低，适合基层诊断使用。

1.2.6 重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA 是一种等温DNA 扩增技术，已成为用于分子诊断的有吸引力的PCR 替代方法。RPA 反应在恒定温度下即可进行，不需要昂贵的热循环仪，对粗制样品具有高度抗性，并且反应可在约20 min 内完成。与实时PCR 相比，简单、经济，快速[20]。Wang 等[21]设计靶向p72 基因保守区域引物和外切探针，以含有p72 基因的重组质粒为模板建立RPA 方法。此方法最低限度可检测每个反应102个拷贝，灵敏度与RT-PCR 相当，与常见猪病毒无交叉反应，特异性良好。Miao 等[22]以ASFV p72 基因建立RPA 与侧向流试纸方法（RPA-LFD），对ASFV 的敏感性为38 ℃ 10 min 内每次反应达150 个拷贝，与其他猪病毒无交叉反应，但易出现核酸污染，因此操作需要小心，而其简单、便捷、经济等优点，为ASFV 现场检测提供了新的替代方案。

1.3 小结

病原学检测是针对病原体自身的检测，能够在ASF 暴发早期，检测出动物体内是否带毒，相较于抗体检测更快一些。病毒分离操作复杂，适用于病毒分子研究；核酸PCR 类检测比较普遍，灵敏性很高，操作便捷，但核酸污染易出现假阳性，可用作鉴别诊断；LAMP、RPA 等等温扩增检测方法快速简单，不依赖复杂仪器，现有专为户外使用而设计的RPA 类便携式设备Genie Ⅲ，轻便易于携带，更适用于现场诊断。病原学诊断方法各有特点（表1），检测人员可根据其优缺点选择合适方案进行诊断。

表1 ASFV 病原学检测技术及其优缺点

2 血清学诊断技术

2.1 抗原检测

2.1.1 荧光抗体技术（fluorescent antibody test，FAT） FAT 是常用的抗原检测方法之一，具有快速、敏感、特异性高等优点，对急性病例的检出率较高。FAT 能够检测组织涂片或HAD 阴性白细胞培养物中的ASFV 抗原[23-24]。采用丙酮固定样本10 min 后，滴加异硫氰酸荧光素（FITC）偶联抗ASFV 抗体，再用荧光显微镜观察巨噬细胞的胞浆中是否有荧光，即可据此判断是否为阳性[25-26]。现已证明，此种技术可用于鉴定12 种非血细胞吸附ASFV 毒株[7]。但此技术所需的冷冻组织切片要求在BSL-3 实验室进行，所以不能用于现场检测。此外，该技术对亚急性和慢性ASF 病例敏感性较差，因在慢性感染过程中形成的抗原抗体复合物可竞争性地阻断ASFV 抗原和抗体的结合，从而出现假阴性[24]，因此一般只用作辅助检测方法。此外，荧光抗体技术通常也用于ASFV 的体外细胞培养，通过病毒定位检测复制类型等。

2.1.2 双抗夹心ELISA 或捕获ELISA 这种方法是在特异性单抗包被的酶标板中加入抗原，使抗原与单抗特异性结合，再加入抗原另一表位的酶标单抗，结合后加底物显色，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。Vidal 等[27]建立了抗ASFV vp73 蛋白特异单克隆抗体的双夹心ELISA 方法。该测定法能检测到的最低全病毒颗粒为2.3×102PFU/mL，最低能检测到的vp73 抗原浓度为0.05 μg/mL。西班牙INGENASA 夹心ELISA 试剂盒，通过包被p72（p73）蛋白特异单克隆抗体来检测病毒抗原，其特异性、敏感性均很好，并被OIE 指定为参考的ASF 诊断试剂盒。

2.1.3 侧向流动免疫色谱分析（lateral flow assay，LFA） LFA 是利用生物学物质或化学物质相互特异性附着的性质，快速对分析物质进行定性或定量分析的方法。Sastre 等[28]基于vp72 蛋白的单抗建立LFA 方法，结果表明病毒的最低检测限度为104PFU/mL，虽敏感性不如RT-PCR，但其快速便携、经济易用，为现场诊断提供了一种选择。此外，Sastre 等[29]还基于vp72 蛋白建立双重侧向流动测定法，用于同时检测针对ASFV 和CSFV 的抗体，结果显示也具有良好的灵敏度和特异性水平。

2.2 抗体检测

2.2.1 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA 是OIE 指定的非洲猪瘟首选血清学诊断方法，其方便快速、敏感特异，并可使用自动化设备检测大量样本，为目前最广泛的血清学检测技术。国内外常用作检测ASFV 抗原的蛋白有p73、p72、p54、p32/p30等，ELISA 方法通过这些蛋白能够直接检测出较低或中等毒力的感染猪抗体。常规ELISA 使用来源于感染猴肾细胞（Vero 或 MS 细胞系）的病毒蛋白p72 抗原[30]。Wardley 等[31]在1979 年首次使用ELISA 鉴别ASFV 抗原和抗体，重复性好，能够检测到50～500 HAD50/mL 的有限抗原浓度。靳雯雯等[32]以ASFV vp73 蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA 方法检测猪血清中抗ASF vp73 蛋白的抗体，对ASFV 阳性血清灵敏度高达1:2 560，具有良好的特异性和敏感性、较好的重复性和稳定性。曹琛福等[33]基于vp54 蛋白作为包被抗原建立竞争ELISA 方法，结果特异性达到100%，灵敏度达到96.22%，与西班牙INGENASA 试剂盒符合率为98.13%。但此方法不能诊断低毒力和高毒力菌株，因此对此类毒株检测要配合其他诊断方法。

2.2.2 胶体金快速免疫层析法（goldimmunochromatography assay，GICA） GICA 是 近年来发展迅速的一项诊断技术。Beggs 等[34]首次用GICA测定人绒毛膜促性腺激素，该方法具有快速、灵敏、特异等优点，尤其适合临床的快速诊断。张鑫宇等[35]建立的p54 抗体检测胶体金免疫层析试纸，具有高度特异性，与猪其他病毒抗体阳性血清无交叉反应，在ASF 防控中具有良好的应用前景。

2.2.3 间接荧光抗体试验（indirect fluorescent anti-body test，IFA） IFA 是用荧光标记的二抗与抗原抗体复合物特异结合，最后在荧光显微镜下观察结果的一种方法[36]。

2.2.4 免疫印迹检测（immunoblotting test，IBT） IBT 是一种将蛋白质电泳技术和血清学结合的免疫生化技术，其特异性高，可检测出弱阳性样本[37]。IBT 可做为IFA 诊断技术的替代方法。

2.3 小结

血清学诊断是通过检测血清中的抗原或抗体来确定体内是否存有ASFV。此类诊断方法繁多，也很成熟，主要优缺点见表2。FAT 一般作为辅助性检测方法，当用于亚急性或慢性疾病检测时，其灵敏性不如ELISA 或荧光定量PCR；ELISA 诊断技术虽然已经很成熟，但操作繁琐，要求较高；GICA、LFA 检测迅速，但只能用于初步诊断，不能定量，适用于基层诊断；IBT 成本较高，操作复杂，适用于实验室定性定量等专业测定。实际诊断运用中，常常联合应用多种诊断方法，各取所长。

表2 ASFV 血清学检测技术及其优缺点

3 展望

ASF 是外来动物疫病，但已在全球流行近百年，一旦暴发便会对疫区造成灾难性打击。目前尚未研制出有效商业化疫苗，用于ASF 早期预防，这就需要效率更高的诊断技术用于ASF 排查。综上不难发现，病原学诊断和血清学诊断技术应用广泛，其中qPCR、RPA、GICA、LAMP 等技术灵敏快速，近年来发展迅速，在ASF 暴发前能起到高效排查作用，具有很好的发展前景。各种诊断方法虽很成熟，但各有优缺点，今后的发展趋势在于不同诊断技术的联合应用，如RPA-LFD、多重PCR联合自动电子芯片[38]等。