NaAsO2中毒对大鼠左心收缩功能及心脏毒性的影响

砷等重金属污染的水源和食物已经造成全球性的公共环境卫生问题[1]。若长期接触砷会引起心血管系统疾病以及多组织器官的毒性效应[2]，如在心电图可表现为QT间期显著延长，甚至导致心脏骤停[3]。

相关流行病学研究证实，职业性的砷暴露是引起心肺呼吸系统的风险因素[4]。既往研究显示，砷暴露的发生使得机体的心脏功能产生障碍[5]。目前已经有研究证明砷可以影响心脏和血管效应，同时在慢性砷暴露过程中引发高血压等症状[6]。关于砷的心脏毒性，相关研究认为，砷能够刺激血管内皮细胞，进而导致细胞内的活性氧水平上升[7]。越来越多的研究证实，氧化应激可能是砷导致细胞毒性的重要机制之一[8]。

本实验通过建立大鼠染毒模型，进一步观察NaAsO2中毒对SD大鼠左心功能、心肌纤维形态学结构的影响以及氧化应激反应对心肌组织细胞产生的作用，探讨NaAsO2中毒导致心肌受损及左心功能降低的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取12周龄、雄性SPF级SD大鼠48只[由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供，生产许可证SCXK(新)2011-0004]，体重（220±20）g。采用完全随机法分为4组，包括正常对照组及低、中、高剂量NaAsO2染毒组，每组12只。正常对照组饮用蒸馏水，低、中、高剂量NaAsO2染毒组分别饮用由蒸馏水配制的5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg的NaAsO2溶液。大鼠饲养温度为（21±2）℃，湿度为40%～60%，持续染毒12周。

1.2 实验仪器 GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，NaAsO2（美国Sigma公司），超低温4℃离心机（美国，Thermo公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司），全自动Bio-rad酶标仪（美国Biorad公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 超声检测 心功能检测采用GE Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪，心脏探头型号12 S，探查频率12 MHz，扫描速度100 mm/s。检测各组大鼠的心功能。腹腔注射10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠，仰卧位固定于检查台上，将探头置于大鼠左胸缘，采取胸骨旁左心室长轴切面、左心室乳头肌水平（测量M型曲线）、大动脉短轴切面，分别测量左心室舒张末期内径（LVIDd）与左心室收缩末期内径（LVIDs）、心输出量（CO）、室间隔舒张末期厚度（IVSd）与收缩末期厚度（IVSs）、左心室舒张末期后壁厚度（LVPWd）与收缩末期后壁厚度（LVPWs）、左心室舒张末期容 积（LVDV）与收缩末期容积（LVSV），左心室短轴缩短率（LVFS）与左心室射血分数（LVEF）。由于大鼠的胸壁薄，心率快（300～400次/min），每组数据均取连续3个心动周期的平均值。

1.4 取材及标本制备 持续染毒12周后，每组随机抽取6只行腹腔麻醉后，用4%多聚甲醛溶液对心脏再灌注，进行固定。摘取心脏组织时，需要迅速开胸,同时在冰上迅速分离心脏与胸腔内的其他组织，并快速用预冷生理盐水冲洗组织3次，滤纸吸干，称重，保留完整的左心室（包括室间隔），在1.5 ml EP管中加入适量4%多聚甲醛溶液进一步固定。

1.5 左心室胶原纤维Masson染色 取出固定在4%多聚甲醛溶液中的组织，经组织脱水、二甲苯透明及石蜡包埋等步骤后，进行冠状位切片，切片厚度5 μm；在固定切片后，石蜡切片、脱蜡，依次用自来水和蒸馏水水洗，随后采用Regaud苏木精染液或Weigert苏木精液染核5～10 min，充分水洗，然后置于Masson丽春红酸性复红液8 min后，冰醋酸水溶液浸洗，置入磷钨酸后直接用苯胺蓝或光绿液染5 min，脱水透明后封片。在倒置显微镜下观察心肌间质胶原纤维分布情况。

1.6 心肌组织细胞中SOD活力和GSH、MDA水平测定 各组大鼠分别取6只，深度麻醉后脱颈处死，摘取心脏组织后，尽快剪碎心肌组织块，使用超声机粉碎，制备成10%的心肌组织匀浆液，1000 r/min离心10 min；然后取上清液，检测SOD活力、GSH及MDA水平。实验重复3次。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0软件，计量资料以表示，两组间比较采用成组资料t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。实验重复≥3次。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 超声心动图检测结果 ①心腔及左心室后壁动度、厚度变化：与对照组比较，NaAsO2染毒组大鼠心腔较大，LVIDd和LVIDs增大（图1、2），室间隔及左心室后壁变厚（表1），室壁增厚且运动幅度减小（图2）。②心功能参数的变化：与正常对照组比较，染毒组大鼠的LVEF、LVFS明显下降、心率显著增快（P<0.05，表1）。染毒组2只大鼠出现少量心包积液，2只出现中量心包积液（图3）；正常对照组未出现心腔扩张、LVEF下降和心包积液。见表1。

表1 超声心动图检测大鼠心功能参数（±s，每组n=6）

表1 超声心动图检测大鼠心功能参数（±s，每组n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；LVIDd：左心室舒张末期内径；LVIDS：左心室收缩末期内径；LVFS：左心室短轴缩短率；LVEF：左心室射血分数；IVSd：室间隔舒张末期厚度；IVSs：室间隔收缩末期厚度；LVPWd：左心室舒张末期后壁厚度；LVPWs：左心室收缩末期后壁厚度

参数 对照组 低NaAsO2染毒组 中NaAsO2染毒组 高NaAsO2染毒组 心率（次/min）364±22 389±21 399±29 451±26 6.70±0.37 LVIDS（mm）2.68±0.19 2.81±0.24 3.29±0.27 4.19±0.22 LVIDd（mm）4.80±0.23 4.89±0.31 5.21±0.29 38.79±1.64* LVEF（%）83.92±2.39 82.81±2.46* 77.14±2.90* 69.89±2.35* LVFS（%）49.28±1.71 48.92±1.89* 44.59±1.54* 1.89±0.14 IVSs（mm）2.31±0.21 2.32±0.21 2.37±0.19 2.48±0.25 IVSd（mm）1.61±0.09 1.66±0.15 1.74±0.17 1.93±0.24 LVPWs（mm）2.01±0.21 2.09±0.29 2.17±0.19 2.21±0.20 LVPWd（mm）1.77±0.16 1.79±0.20 1.85±0.17

图1 NaAsO2染毒大鼠胸骨旁大动脉短轴及心尖四腔心切面。PA为肺动脉，AO为主动脉，RV为右心室，RA为右心房，LV为左心室，LA为左心房

图2 NaAsO2染毒大鼠胸骨旁左心室长轴二维超声及M型超声心动图切面。IVS为室间隔，LVPW为左心室后壁

图3 NaAsO2染毒大鼠胸骨旁左心室短轴切面。LV为左心室，PE为心包积液

2.2 光镜下观察大鼠左心室心肌胶原纤维的变化Masson染色显示，正常对照组大鼠心肌肌间隙较窄，清晰可见，在紧密排列的心肌细胞之间可见少量蓝染的胶原纤维，胶原纤维分布稀疏，着色淡。NaAsO2染毒组大鼠心肌细胞肥大，心肌间隙明显增宽，部分心肌间质以及血管旁蓝色的肌间隙中的胶原纤维呈栅栏样排列，且排列顺序紊乱，纤维数量显著增多，随着NaAsO2浓度升高，心肌中胶原纤维增加（图4）。

图4 Masson染色观察NaAsO2染毒大鼠心肌纤维形态结构变化。A：对照组，B：低NaAsO2染毒组，C：高NaAsO2染毒组。对照组大鼠的心肌肌间隙较NaAsO2染毒组窄，心肌细胞间可见少量胶原纤维，且分布较为稀疏。NaAsO2染毒组大鼠的心肌细胞明显肥大，肌间隙显著增宽，胶原纤维增多，且排列紊乱（×100）

2.3 各组大鼠心脏组织细胞中SOD活力、GSH和MDA水平的变化 与正常对照组比较，低、中、高NaAsO2染毒组SOD活性和GSH水平依次降低，MDA水平依次上升，差异均有统计学意义（P<0.05）。与NaAsO2低浓度组相比，NaAsO2高浓度组SOD活性明显降低（P<0.05）；而中、高NaAsO2染毒组MDA含量依次增加（P<0.05），各染毒组组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05，表2）。

表2 各组大鼠心脏组织细胞中SOD活力、GSH和MDA水平（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与低NaAsO2染毒组比较，#P<0.05；与中NaAsO2染毒组比较，ΔP<0.05

分组 鼠数 SOD（U/mgprot）GSH（U/mgprot）MDA（U/mgprot）对照组 6 187.26±5.92 19.34±0.53 17.06±1.21 36.78±1.41* 中NaAsO2染毒组 6 112.77±4.68*# 8.42±0.42*# 48.33±1.37*# 低NaAsO2染毒组 6 139.35±5.21* 12.76±0.49* 68.70±1.79*#Δ F值 382.69 625.12 1092.94 高NaAsO2染毒组 6 71.31±4.49*#Δ P值 5.44±0.37*#Δ ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 讨论

砷是地壳中普遍存在的较丰量的元素之一，流行病学和实验研究已证明，砷在高血压的发病及其他心血管疾病中具有重要作用[9]。本研究通过建立大鼠NaAsO2染毒模型，使用超声检测发现，与对照组比较，NaAsO2染毒组大鼠心腔增大，LVIDd和LVIDs增大，室间隔及左心室后壁变厚，室壁增厚且运动幅度减小。染毒组的LVEF、LVFS明显下降、心率显著增快，且有大鼠出现心包积液等特征，而正常对照组无上述表现。有研究证实，在低浓度砷暴露情况下，大鼠心率能够轻微增加，而较高剂量的砷则会导致大鼠心率过缓，发生心律失常[10]。

砷中毒可能会导致机体血压升高，从而导致左心室重塑，同时使心脏收缩与舒张功能产生障碍[11]。LVEF和LVFS是心脏收缩功能的常用超声参数，两者呈同向变化，血压升高时，无论伴或不伴左心室肥厚，用M型超声心动图评价心脏收缩功能均较FS合理，其原因是FS的测量以心内膜为基础，能够反映排血功能，同时FS的增减容易受到心脏前后负荷变化的影响[12-13]。

心室重构改变主要表现为：①左心室肥大：心肌细胞体积的显著增大，心肌重量明显增加；②心肌间质纤维化：间质中胶原纤维的积聚、增多[14]。有研究证明，左心室重塑很可能是机械因素所致，即左心室压力负荷呈现持续性增大[15]，其主要机制是心肌细胞通过离子通道和细胞形变转导等，导致心肌蛋白的合成增加，最终促进心肌细胞肥大及心肌间质纤维化，进而产生左心室重塑[14,16]。而机体在吸收砷剂后，通过血液循环，累及各处的组织和器官[17]。本实验光镜观察显示，对照组大鼠的心肌肌间隙较实验组窄，心肌细胞之间可见少量的胶原纤维，且分布较为稀疏。NaAsO2染毒组大鼠心肌细胞明显肥大，肌间隙显著增宽，胶原纤维较对照组增多，且排列紊乱，胶原染色明显增加。

由于砷可以对机体相关组织的抗氧化-还原系统产生一定影响，因此，可能成为砷中毒对机体器官及组织细胞的损害作用机制之一。Saad等[18]研究显示，在给予大鼠连续染毒10 d后，肌酸激酶同工酶（CKMB）、乳酸脱氢酶及谷氨酸氨基转移酶水平明显升高，而在心肌组织中，还原型GSH含量降低，而MDA及亚硝酸盐显著升高。

砷会诱发机体中氧化应激损伤因子，活性氧的过量产生，同时造成DNA、脂质和蛋白质损伤，最终诱导细胞发生凋亡[19]。而活性氧在机体内过量产生会受到相关抗氧化酶，如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、过氧化物酶（CAT）等的催化，进而失活被清除。相关实验研究表明，H9C2细胞经过砷剂的处理后，细胞内会产生大量活性氧，而经维生素E预处理后，显著抑制砷剂所诱导的活性氧水平上升[20]。体内外大量实验研究表明，给予砷剂后，机体细胞和组织中的GSHPX、CAT、SOD活性会明显降低，而MDA水平则显著增加[21]，与本实验研究结果一致，提示在砷剂导致大鼠心脏损伤过程中，大鼠心肌细胞氧化平衡状态受损是其关键因素。

总之，在NaAsO2所诱导的机体砷中毒的作用机制主要是，砷毒性直接损伤机体的抗氧化系统功能，使SOD活性及GSH水平下降，MDA水平增加，机体中抗氧化能力显著减弱；同时改变了左心室功能，并可能导致大鼠血压升高，影响心肌纤维化。由此可见，NaAsO2致大鼠心脏毒性效应以及左心功能降低的机制之一可能与氧化应激有关。