顶空毛细管气相色谱-热导检测器法测定抗菌药物中的水分*

符传武，洪薇，钟文俊，覃华亮，覃子龙，李俊霖，刘永逸

(柳州市食品药品检验所，柳州 545006)

水分会影响抗菌药物的稳定，造成药效降低，甚至会使抗菌药物降解，产生对人体有害的物质[1]，因此，抗菌药物中的水分是药品质量控制中一项特别重要的指标。目前国内公开报道的抗菌药物水分的测定有卡尔费休氏法[2-10]、微波加热法[11]、减压干燥法[12]和近红外光谱法[13-17]，其中报道最多的是采用卡尔费休法。

卡尔费休法是Karl Fischer在1935年提出的测定水分的分析方法[18]，其原理是利用碘将二氧化硫氧化为三氧化硫时，需要一定量的水参与反应，由消耗碘的量计算出水分的含量，它属于水分测定的经典方法，已被列为许多物质中水分测定的标准方法[19]，在《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832收载有此法，用于测定药品中水分的含量。其具有对水选择性强、准确和精密度高、样品用量少及样品制备简单等优点，但该法所使用的试液及试剂有较高的毒性，对环境及检测人员的身体健康构成了较大的威胁，因此建立一种对人体危害小又能批量快速测定抗菌药物中水分的检测方法非常有必要。

笔者目前还未见有关采用顶空毛细管气相色谱-热导检测器法测定抗菌药物中水分的文献报道。笔者采用对人员和环境较为友好的乙醇提取试剂，所建立的气相色谱法能快速、准确地测定抗菌药物中的水分。

1 仪器与试药

1.1仪器 GC-2010 Plus气相色谱仪、热导检测器(TCD，日本岛津公司)；XS205DU电子分析天平(瑞士Mettler 公司，感量：0.01 mg)。

1.2试药 阿莫西林胶囊(华北制药股份有限公司，简称HB，哈药集团制药总厂，简称HY，瑞阳制药有限公司，简称RY，吉林万通药业集团梅河药业股份有限公司，简称WT，山东鲁抗医药股份有限公司，简称LK，先声药业有限公司，简称XS，四川峨眉山药业有限公司，简称EMS，成都锦华药业有限责任公司，简称JH，批号分别为F6102316，A1503168，15051702，20161015，1610026，02-161108，20170301，170304)；头孢氨苄胶囊(山东鲁抗医药股份有限公司，批号：160701)；头孢克肟胶囊(天津华津制药有限公司，简称HJ，批号：6E262C)；头孢克肟片(白云山制药总厂，简称BYS，山东罗欣药业集团股份有限公司，简称LX，湖南方盛制药股份有限公司，简称FS，山东罗欣药业集团股份有限公司，浙江巨泰药业有限公司，简称JT，山东鲁抗医药股份有限公司，批号分别为20170005，617042312，170301，617102202，T01170601，170203)；头孢克洛片(石药集团欧意药业有限公司，简称OY，白云山制药总厂，批号分别为021170601，20170003)；头孢丙烯片(山东罗欣药业集团股份有限公司，批号：617052243X)；头孢拉定片(湖南科伦制药有限公司，简称KL，批号：H150604)；乙醇(含量99.9%，色谱纯)；甲醇(北京百灵威科技有限公司，含量99.8%，色谱纯)；水为Ⅰ级纯化水。

2 方法与结果

2.1色谱条件 采用顶空毛细管气相色谱-热导检测器法进行测定，使用Agilent HP-PLOT/Q毛细管色谱柱(30 m×0.530 mm，40 μm)；载气为高纯氦气，流量3 mL·min-1；进样量250 μL，分流比20：1，进样口温度为200 ℃；顶空进样，采用气密针模式的顶空进样(气密针温度为95 ℃)，顶空瓶的平衡温度为85 ℃，平衡时间为10 min；柱温箱：采取程序升温，初始温度150 ℃，保持6 min，以60 ℃·min-1的速率升到250 ℃，保持5 min；热导检测器温度为250 ℃，电流为70 mA。

2.2溶液的制备

2.2.1内标提取溶液 取甲醇4 mL，用乙醇定容至1000 mL，作为内标提取溶液。

2.2.2溶剂空白溶液 精密加入内标提取溶液3 mL，置20 mL顶空进样瓶中，密封，作为溶剂空白溶液。

2.2.3对照品溶液 精密称取水15 mg，置20 mL顶空进样瓶中，精密加入内标提取溶液3 mL，密封，作为对照品溶液。

2.2.4供试品溶液 精密称取样品0.1 g，置20 mL顶空进样瓶中，精密加入内标提取溶液3 mL，密封，作为供试品溶液。

2.3系统适用性实验及专属性考察 取一个20 mL顶空进样瓶密封为A瓶；取3 mL水置20 mL顶空进样瓶中密封，为B瓶；取3 mL甲醇，置20 mL的顶空进样瓶中密封为C瓶。取上述的溶剂空白溶液、对照品溶液及供试品溶液作为系统适用性考察供试品。分别精密吸取250 μL注入气相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱图。理论板数以水和甲醇峰计，均不低于20 000，各峰分离度均大于1.5。水保留时间约为2.1 min，甲醇保留时间约为2.7 min(图1)，由于溶剂空白中含有水峰，故本次测定采取扣除本底的方法以消除对测定结果的影响。

2.4线性关系考察 分别精密称取水适量，置20 mL顶空进样瓶中，精密加入内标提取溶液3 mL，密封，配制浓度为1.717，3.333，5.000，8.333，16.667 mg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密量取250 μL，注入气相色谱仪，记录图谱，以水的色谱峰(扣除溶剂中水的峰面积)与内标甲醇峰比值(Y=A水/A内)，分别对其浓度(C，mg·mL-1)进行线性回归。结果回归方程和相关系数分别为：Y=0.201 2C+0.006 0，r=0.999 8，表明水峰在含量为1.717～16.667 mg·mL-1范围内线性良好。

2.5精密度实验 取“2.2.2”项的溶剂空白溶液6份，按“2.1”项色谱条件，每份进样1次，结果水峰与甲醇峰比值(K=A水/A内)的RSD为 4.4%，说明仪器精密度良好。

2.6重复性实验 取同一批(批号：02-161108)样品6份，精密称定，按 “2.2.4”项制备供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进行测定，记录色谱图，计算水的平均含量为12.55%，RSD 为 4.7%。结果表明该方法重复性较好。

2.7加样回收率实验 精密称取同一批(批号：02-161108)已知水分含量的阿莫西林胶囊样品9份，每份约0.05 g，加入水适量，照“2.2.4”项供试品溶液配制的方法配制低、中、高3种浓度的溶液，并按上述色谱条件下进行测定，计算回收率及RSD，结果平均回收率为92.76%～103.55%，RSD均在5.0%范围内，见表1。

2.8稳定性实验 取同一批(批号：02-161108)样品4份，精密称定，按 “2.2.4”项制备供试品溶液，在室温下放置0，3，6，12 h测定，记录主峰面积，结果表明，样品中水的含量无明显变化，其RSD为5.7%。

1.空气；2.水；3.甲醇；4.乙醇。图1 空气(A)、水(B)、甲醇(C)、溶剂空白(D)、对照品溶液(E)、供试品溶液(F)色谱图 1.air;2.water;3.methanol;4.ethanol.Fig.1 GC chromatogram of air (A),water (B),methanol (C),blank solvent (D),reference substances (E)and sample solution (F)

表1 阿莫西林加样回收率测定结果Tab.1 Results of recovery test of amoxicillin n=3

2.9样品测定 精密称取20个抗菌药物样品，照“2.2.4”项的方法制备溶液；按“2.1”项的色谱条件，记录色谱图。按内标法以峰面积计算水的含量，同时用法定检测方法——费休法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832第一法)对其测定，结果用费休法和气相法测定结果无显著差异，且均符合标准的规定，见表2。

3 讨论

3.1顶空条件的考察 本次顶空条件考察使用批号为02-161108的样品，为了便于考察方法的可靠性，本研究先用费休法测定其水分的含量(12.7%)，再将顶空条件的考察结果与其进行比较，最终确定与费休法测定结果无显著差异的顶空条件。

取样量及提取溶剂考察：在样品瓶平衡温度为85 ℃，平衡时间为30 min以下，考察了取样量为0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，提取溶剂加入量为3，5，10 mL时抗菌药物中水的含量，结果显示，当取样量为0.05或0.1 g，提取溶剂加入量为3，5，10 mL时，测定结果与费休法测定结果无显著差异。

取样量及样品平衡时间的考察：在平衡温度为85 ℃，提取溶剂加入量为3 mL时，考察了取样量为0.05，0.1，0.25，0.5，1.0 g，顶空进样瓶平衡时间为5，10，20，30 min，结果显示，当取样量为0.05或0.1 g，顶空进样瓶平衡时间为10，20，30 min，本法测定结果与费休法测定结果无显著差异。

样品瓶平衡温度的考察：当空白溶剂溶液、对照品溶液、供试品溶液精密加入内标提取溶液3 mL，取样量为0.05，0.1 g，平衡时间为10 min时，样品瓶平衡温度为85 ℃，其测定结果与费休法测定结果无显著差异；当样品瓶平衡温度为75或65 ℃时，其测定结果比费休法测定结果偏低。

3.2测定方法的选择 文献报道测定抗菌药物中的水分主要有近红外法[13-17]、干燥失重法与费休法[7]。近红外法测定水分快速、简便，但前期必须花大量的精力来建立相关的定量模块；干燥失重法设备便宜，操作简单，但由于部分抗菌药物含有挥发溶剂，不能很准确反映抗菌药物真实水分的含量；费休法专属性强，准确度高，但其所使用的试剂毒性较大，不符合当今绿色检测的理念。笔者参考有关文献[20-22]，使用顶空毛细管气相色谱-热导检测器，测定抗菌药物中的水分，所使用的试剂较为环保，试剂使用量少，前处理操作简单，测定结果准确可靠。

表2 样品含量测定结果Tab.2 Results of content determination on the samples n=3

3.3含量计算方法的选择 为了消除样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响及后期计算的便利，本次实验采用内标一点法进行定量分析，经比较，内标一点法计算的结果有较好的重复性。由于提取溶剂中含有部分水，计算时必须把这部分的水量扣除，具体计算公式如下：

(1)内标提取溶液校正因子计算公式：K=A水1/A甲醇1

(2)对照品校正因子计算公式：F=A甲醇2×C水2/[(A水2-K×A甲醇2)×C甲醇2]

(3)样品含水量计算公式：水%=[F×(A水3-K×A甲醇3)×C甲醇3×N]/A甲醇3×W×1000×100%

K为内标提取溶液校正因子；A水1为内标提取溶液水的峰面积；A甲醇1为内标提取溶液甲醇的峰面积；F为对照品溶液校正因子；A水2为对照品溶液水的峰面积；A甲醇2为对照品溶液甲醇的峰面积；C水2为对照品溶液水的含量，单位为mg·mL-1；C甲醇2为对照品溶液甲醇的含量，单位为%；A水3为供试品溶液中水的峰面积；A甲醇3为供试品溶液中甲醇的峰面积；C甲醇3为供试品溶液中甲醇的浓度，单位为%；N为稀释倍数；W为供试品取样量，单位为g；1000为单位换算系数。

3.4色谱柱的选择及程序升温条件的优化 选取3根不同型号的色谱柱：HP-PLOT/Q(30 m×0.530 mm，40 μm)，150 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升温至250 ℃，保持5 min；DB-624(30 m×0.530 mm，3 μm)，60 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1升温至140 ℃，保持1 min；DB-FFAP(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，60 ℃保持6 min，以60 ℃·min-1升温至200 ℃，保持2 min。结果3根色谱柱各峰分离度均大于1.5，理论板数以水和甲醇峰计，均在20 000以上。

3.5进样方式选择 由于液体进样方式会把样品本身及样品中含有的不挥发性组分注入气相色谱中，这不仅会污染进样针，还会污染进样口和色谱柱，故本研究采用较为简便、干净、快速，且不需要使用大量有机溶剂的顶空进样方式进样。

3.6湿度对实验的影响 研究表明，环境的湿度对测定结果重现性有一定的影响[22]，当环境湿度较大时，应该控制实验室的湿度。前处理时应该充分考虑到这一因素，尽量缩短其与空气接触的时间及所用的容器必须干燥。

3.7其他问题 利用本法测定多批注射用头孢曲松钠水分时发现，其测定结果与费休法测定结果有较大差别(费休法测定结果约为本法测定结果的1.7倍)，但与烘干法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0832第二法)测定结果又较为接近，造成此现象的原因，笔者认为是由于头孢曲松钠本身或者注射用头孢曲松钠中所含有的辅料(已有文献报道[1]，辅料无水碳酸钠对费休法测定水分有干扰，致使测定结果偏高)能与碘反应，致使卡尔费休法试剂消耗增加，从而使测定结果偏高，故《中华人民共和国药典》2015年版二部使用费休法测定注射用头孢曲松钠水分的合理性及准确性有待于进一步探讨。

笔者曾考察多个厂家的无水乙醇和含量为99.9%的色谱乙醇，其溶剂均含有一定量的水，在色谱图上有较为明显的色谱峰，故本法无需考察方法的检出限，但为了减少本底的干扰，对照品溶液与供试品溶液的配制必须用同一瓶新配的内标提取溶液，按“3.3”项的计算方法扣除本底的干扰。从“2.9”项样品测定结果可以看出，本计算方法能有效地消除本底水分的干扰。

由于溶剂中含有水分，对含水量较低样品的测定误差可能会比较大，本课题组下一步将继续研究消除溶剂中水分的相关技术，以弥补本法的不足。