橄榄苦苷对脾切除手术后老年大鼠认知功能障碍的影响

李文杰，陈楠

(郑州人民医院药学部，郑州 450003)

手术后认知功能障碍(post operative cognitive dysfunction ，POCD)是手术后易出现的中枢神经系统并发症之一，常见于老年患者，可导致手术后恢复慢、住院时间延长、住院费用增加等，并严重影响患者手术后生活质量[1]。POCD机制尚不清楚，手术创伤所致脑组织氧化应激损伤在其发生和发展中起重要作用，因此拮抗氧化应激损伤是预防、减轻POCD的重要措施。橄榄苦苷(oleuropein)是来源于橄榄及橄榄油的酚类化合物成分之一。近年来，橄榄苦苷的药理作用得到广泛的研究，其具有抗肿瘤、保肝护肾、保护心脑血管、降低血糖、降血压、抗炎、治疗阿尔茨海默病等作用[2]。橄榄苦苷抗氧化作用显著[3]，能够有效缓解心肌氧化应激损伤[4]，但其是否对POCD有预防或减轻作用尚不清楚。因此，笔者拟建立大鼠脾切除手术后POCD模型，评价橄榄苦苷对手术后大鼠认知功能的作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1实验主要试剂、设备及动物 橄榄苦苷(上海纯优生物，批号170612-2，含量>98%)，溶于二甲亚砜(DMSO)中配制为10 mmol·L-1的原液，保存备用。二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：20141216)；Rabbit Anti-β-Actin(Santa Cruz 公司，批号：sc-47778)；Nrf2 Rabbit mAb (CST公司，批号：D1Z9C)；Rabbit Anti-ERK1/2(p44/42 MAPK)(CST公司，批号：BY-04637)；核蛋白提取试剂盒(Phygene生物技术有限公司，批号：PH0324)；NBS超低温冰箱(北京五洲东方科技有限公司术有限公司，型号：U410-86)；全波长酶标仪(美国DYNEX 公司，型号：Spectra Mr)；高速冷冻离心机(德国HERMLE 公司，型号：Z-323)。Morris水迷宫装置[基尔顿生物科技(上海)有限公司](水池直径150 cm，高50 cm，站台直径9.5 cm)。无特定病原体(SPF)级SD大鼠，雄性，18个月龄，体质量350～400 g，购自河南省实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(豫)2014-0003。动物房按照SPF级动物饲养标准保持恒温、恒湿，昼夜交替时间12 h。动物不限饮食、饮水。

1.2动物分组和处理 大鼠分组应用随机数字表法，分为假手术组、手术组和橄榄苦苷组(小、大剂量)，根据时间点细分为手术后1 d组、手术后3 d组、手术后5 d组，每组10只大鼠。小、大剂量橄榄苦苷组大鼠于手术后1，3 和 5 d分别灌胃给予橄榄苦苷20，50 mg· kg-1，假手术组、手术组大鼠手术后1，3和 5 d分别灌胃给予等量的溶媒。橄榄苦苷浓度选择参照文献[5]。

1.3模型建立 模型建立参照文献[6]。手术组大鼠给予10%水合氯醛(剂量3.0 mL·kg-1)腹腔注射，达到理想麻醉效果(翻正反射消失)后，仰卧位于大鼠板上固定，术区备皮消毒，切口沿肋缘下横切长2～3 cm，打开腹腔，探查到脾脏，离断脾蒂，分离结扎脾血管，完整摘除脾脏，充分止血，用聚维酮碘消毒伤口，逐层关腹并缝合切口，切口处喷洒青霉素粉预防感染，用无菌敷料贴覆盖，胶布固定。假手术组大鼠同样方法麻醉，切皮后缝合，切口处喷洒青霉素粉。

1.4认知功能测试 采用经典Morris水迷宫，在术前5 d开始进行大鼠认知功能训练，实验方法如下：平台放于水面下1 cm，放置于第Ⅰ象限。将大鼠随机(头朝池壁)从4个象限置入水中，记录老年大鼠找到水下放置的平台的时间，标记为潜伏期(s)，找到平台后让其在平台上停留10 s。寻台时间超过60 s者，则轻托大鼠到平台，并在平台上停留10 s，记录潜伏期为60 s。接着撤去平台，将大鼠由第Ⅰ象限对侧轻放入水中，自由游泳60 s。记录大鼠在目标象限(第Ⅰ象限)游泳的时间和进入此象限的次数。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔30 min，连续训练5 d。每次训练结束后将大鼠擦干，放回笼内。训练最后一天的4次训练成绩为术前平均成绩。手术后第1，3，5 天按照上述训练方法测试并记录大鼠的潜伏期、穿台次数及游泳时间。

1.5海马组织胞浆蛋白和胞核蛋白的提取 每组大鼠测试结束后，立即处死，液氮上快速分离大鼠双侧脑区海马组织，称质量，剪碎，置于冰浴的研磨器皿中，根据比例加入适量4 ℃预冷磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution，PBS)充分匀浆至无肉眼可见组织，4 ℃、500 r·min-1(r=8 cm)离心5 min，收集细胞。加入浆蛋白抽提试剂(含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂)，高速涡旋15 s确保细胞沉淀分散完全，冰浴中静置10 min，剧烈高速涡旋10 s，4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)离心10 min，取上清液，立即转移入预冷的样品管中置-20 ℃保存备用，此为胞浆蛋白。在离心沉淀物(细胞核)中加入核蛋白抽提试剂，高速涡旋15 s确保细胞沉淀分散完全，提取过程同浆蛋白。4 ℃、12 000 r·min-1(r=8 cm)离心10 min后取上清液即得核蛋白，-20 ℃保存备用。实验时取出样品，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。

1.6酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠海马组织内MDA含量和SOD水平 取胞浆蛋白检测SOD及MDA水平。SOD活性应用氮蓝四唑(NBT)法检测，取MDA检测工作液，加入组织样品中，混匀，100 ℃水浴20 min，立即放置水浴中15 min，1000 r·min-1(r=8 cm)离心10 min，取上清液备用。取试剂盒中配备的96孔板中，加入上清液200 μL，利用酶标仪在波长532 nm处测定A值，根据说明书计算组织中SOD活性(U·mg-1)。

1.7Western blotting 实验检测大鼠海马组织内蛋白表达水平 取“1.5”项中样品，加入等量的loading buffer混合，置于100 ℃沸水加热变性后上样，制备10% SDS-PAGE凝胶，电泳法分离蛋白，采用湿转法转移至聚偏二氟乙烯膜，室温条件封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。加入封闭液稀释的一抗(p-ERK1/2 、Nrf2)4 ℃孵育24 h。TBST洗涤3次，每次10 min，二抗[1：1000，辣根过氧化物酶(HRP)标记]37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次，电化学发光法显色，然后利用Image Pro Plus 6.0版软件分析条带的积分吸光度(A)。

2 结果

2.1Morris水迷宫实验结果 手术前各组大鼠潜伏期、穿台次数和游泳时间差异无统计学意义。手术后1 d，与假手术组比较，手术组大鼠潜伏期延长(F=6.27，P<0.05)，穿台次数及游泳时间均差异无统计学意义；与手术组比较，橄榄苦苷组大鼠潜伏期、穿台次数和游泳时间差异无统计学意义。手术后3，5 d，手术组大鼠较假手术组潜伏期延长、穿台次数及游泳时间减少；橄榄苦苷组大鼠较手术组潜伏期缩短(F=7.51，P<0.05；F=13.50，P<0.01)，穿台次数增加(F=23.95，P<0.01；F=34.58，P<0.01)，游泳时间增加(F=19.82，P<0.01；F=13.78，P<0.01)。结果见图1～3。

与假手术组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与手术组比较，*3P<0.05，*4P<0.01。图1 4组大鼠手术前后的潜伏期比较Compared with sham operation group,*1P<0.05，*2P<0.01;compared with surgery group，*3P<0.05，*4P<0.01.Fig.1 Comparison of incubation period among four groups of rats before and after

与假手术组比较，*1P<0.01；与手术组比较，*2P<0.05，*3P<0.01。图2 4组大鼠手术前后的穿台次数比较Compared with sham operation group,*1P<0.01;Compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.2 Comparison of the number of platform-site crossovers among four groups of rats before and after

与假手术组比较，*1P<0.01；与手术组比较，*2P<0.05，*3P<0.01。图3 4组大鼠手术前后的游泳时间比较Compared with sham operation group,*1P<0.01;compared with surgery group，*2P<0.05，*3P<0.01.Fig.3 Comparison of swimming duration among four groups of rats before and after

2.2大鼠手术后SOD活性及MDA含量 结果见表1。

表1 4组大鼠手术后SOD活性及MDA含量比较Tab.1 Comparison of SOD activity and MDA content among four groups of rats after operation

与假手术组同时间点比较，*1P<0.01，*2P<0.05；与手术组同时间点比较，*3P<0.05，*4P<0.01。
Compared with sham operation group at same time point，*1P<0.01，*2P<0.01；Compared with surgery group at same time point，*3P<0.05，*4P<0.01.

与假手术组比较，手术组大鼠海马组织内MDA含量增加，SOD含量减少，表明手术后老年大鼠脑组织内产生了氧化应激损伤。与手术组比较，橄榄苦苷组大鼠海马组织内MDA含量减少(F=22.66，P<0.01；F=35.26，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，SOD增加(F=10.52，P<0.05；F=8.35，P<0.05；F=23.64，P<0.01)，提示橄榄苦苷可能发挥抗氧化作用，减少应激损伤。

2.3大鼠海马组织内蛋白表达的比较 与假手术组比较，手术组大鼠海马组织内p-ERK1/2、n-Nrf2、总Nrf2表达降低。与手术组比较，手术后橄榄苦苷组大鼠海马组织p-ERK1/2表达增加(F=5.83，P<0.05；F=30.96，P<0.01；F=26.32，P<0.01)，n-Nrf2表达增加(F=25.62，P<0.01；F=39.20，P<0.01；F=23.44，P<0.01)，总Nrf2表达增加(F=14.75，P<0.01；F=41.26，P<0.01；F=16.95，P<0.01)。结果见图4。

3 讨论

POCD的风险因素较多，脾切除手术后会导致大鼠出现短暂的认知功能障碍[7]，故笔者选择脾切除手术建立手术后POCD模型，并采用Morris水迷宫方法测试老龄大鼠手术后的认知功能。为排除麻醉方式/药物对POCD的影响，本研究采用统一的麻醉方案。

脾切除手术后机体应激导致脑组织内皮细胞受损，促进炎症反应，同时促进β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的合成，释放氧自由基并在神经元聚集，损伤脑组织，导致认知功能缺陷[8-9]。本研究发现，脾切除手术前各组大鼠潜伏期、穿台次数和游泳时间均差异无统计学意义，即术前实验大鼠认知功能没有差异。手术后大鼠潜伏期延长，穿台次数、游泳时间显著减少，提示手术后大鼠的认知功能受到损伤。给予橄榄苦苷腹腔注射后，手术后大鼠潜伏期缩短，穿台次数及游泳时间增加，提示橄榄苦苷在一定程度上改善了脾切除手术后老年大鼠的认知功能障碍。

A.假手术组；B.手术组；C.橄榄苦苷小剂量组；D.橄榄苦苷大剂量组；与手术组比较，*1P<0.05，*2P<0.01；与假手术组比较，*3P<0.01。图4 4组大鼠手术后海马组织p-ERK1/2、n-Nrf2、总Nrf2的表达A.sham operation group；B.surgery group；C.low-dose oleuropein group；D.high-dose oleuropein group；Compared with surgery group，*1P<0.05，*2P<0.01;compared with sham operation group,*3P<0.01.Fig.4 Comparison of the expression of p-ERK1/2,n-Nrf2 and total Nrf2 in hippocampus among four groups of rats after

在正常生理情况下，机体自由基的生成和清除之间保持动态平衡，在手术创伤、炎症反应等过程中，尤其对于高龄、合并基础疾病、大手术患者，由于机体清除自由基能力减弱，过多的自由基会导致富含脂质的脑组织损伤。自由基可使脑组织脂质过氧化，产生MDA，其在体内含量的多少反映机体过氧化程度的高低。SOD 是一种具有抗氧化作用的酶，其水平的高低反映了机体的抗氧化能力。本研究观察到在脾切除手术后大鼠海马组织内MDA含量显著增加，SOD含量显著减少，此时大鼠潜伏期延长，穿台次数及游泳时间减少，表明手术后由于老年大鼠脑组织内产生了氧化应激损伤，从而影响了大鼠的认知功能。橄榄苦苷组大鼠海马组织内MDA含量减少，SOD增加，潜伏期缩短，穿台次数及游泳时间增加，表明橄榄苦苷发挥了抗氧化作用，改善了大鼠的认知功能。

Nrf2是抗氧化系统重要的调控因子，生理状态下，结合状态的Nrf2位于细胞质中。在氧化应激状态下Nrf2激活并解离，进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)位点相结合，调控多种抗氧化应激蛋白酶的合成。Nrf2-ARE通路可调节细胞内氧化还原平衡[10-11]，属于机体自身内源性抗氧化酶防御体系。文献表明三七总皂苷可能通过上调Nrf2/ARE 信号通路，激活内源性抗氧化酶系统如血红素氧合酶-1(HO-1)、SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，从而抑制Aβ25 -35诱导PC12 细胞氧化应激和凋亡[12]。多种信号通路参与对Nrf2转录活性的调节，如作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族中的一个重要的亚族，ERK通过磷酸Nrf2的方式使其激活解离，发生核转位，诱导下游抗氧化基因表达，发挥细胞保护作用[13-14]。

本研究发现，手术后1 d，手术组的大鼠海马组织内p-ERK1/2、n-Nrf2及总Nrf2水平无变化，手术后3，5 d其表达均显著降低。这可能因为老年大鼠免疫系统调节能力下降，早期适度的手术后应激可促进Nrf2的表达，发挥内源性抗氧化作用，而过度的氧化应激会导致脑组织产生大量的氧自由基，超过了脆弱的海马组织的代偿能力，造成Nrf2表达的下降和核移位减少[15]。Morris水迷宫实验观察到手术后第1天，大鼠的穿台次数及游泳时间与假手术组比较没有变化，也推测可能是手术后大鼠体内内源性抗氧化系统发挥了一定的抗氧化作用。有研究显示在创伤性脑损伤大鼠脑组织内Nrf2-ARE参与了内源性的防御机制，其表达水平在创伤24 h到达高峰，其后逐渐下降[16]。手术后橄榄苦苷组大鼠海马组织p-ERK1/2表达增加，细胞核内 Nrf2及总的Nrf2表达增加，提示橄榄苦苷能够显著上调大鼠海马组织中p-ERK1/2的蛋白表达水平，促进Nrf2的细胞核转位，减少脂质过氧化产物的生成，拮抗手术造成的氧化应激损伤，改善老年大鼠手术后认知功能。

总之，本研究初步表明，橄榄苦苷能够明显改善脾切除手术后老年大鼠认知功能障碍，其机制可能与其抑制激活Nrf2/ERK通路有关。