β-硅酸二钙骨水泥的水化改性及其生物活性的研究

谢洪海 ，王玉清

(1. 山东鲁泰环保建材有限公司， 山东 济宁 272350；2. 济宁市高级职业学校， 山东 济宁 272100)

0 引 言

硅酸钙骨水泥是一种新型自凝的可注射性生物材料，该生物材料具有很好的物理性能、化学性能、生物性能。大量实验证明，由于该材料极好的生物和机械性能在临床领域取得了很大的进步[1]。自1971年，Hence发现了生物活性玻璃，很多钙硅基陶瓷玻璃已经被广泛的研究。其中，β-Ca2SiO4拥有极好的生物活性、降解性、水化性能[2]。然而，β-Ca2SiO4在水化的过程中会生成Ca(OH)2，这种物质的生成会导致局部pH值过高且大于12.5，很不利于周围骨组织的生长，且不可以被人体所吸收[3]。所以，目前最有效的办法就是消除Ca(OH)2并且将其转化为球霰石。

球霰石是碳酸钙的一种矿物晶型[4]。由于球霰石是亚稳相，所以它的溶解度大于文石或者方解石[5]。此外，由于其高比表面积和低比重，球霰石作为一种生物医学材料可用于骨基质的增强[6]。早期的研究表明，微量的可溶性硅物种和45S5生物玻璃中的钙离子可以刺激成骨细胞内的基因并增强IGF-II 的表达，从而促进骨形成[7-9]。据报道，磷酸盐离子会吸附在球霰石表面[10]。Kim和Park[11]报道，含球霰石和多巴胺的混合材料在SBF中很容易转化为碳酸化羟基磷灰石。这些结果表明，水化后的硅酸钙骨水泥可以提高磷的吸附能力，并促进羟基磷灰石的形成。

在本文中，通过将β-Ca2SiO4水化、碳化来制备球形球霰石。这种方法既环保又简单，且可直接将其转化为球霰石。此外，可以通过SBF浸泡来提高骨水泥的生物活性。

1 材料和方法

1.1 β-硅酸二钙粉体的制备

用溶胶凝胶法合成β-Ca2SiO4粉末，在之前的工作中已经描述过[12]。试剂级硅酸乙酯((Si(OC2H5)4；TEOS，SiO2% ≥ 28.4%, 国药集团化学试剂有限公司，中国) 和硝酸钙 ((Ca(NO3)2·4H2O； 99.0%, 西陇化工股份有限公司，中国)作为SiO2和CaO的前驱体。硝酸HNO3作为催化剂，无水乙醇作为溶剂。SiO2和CaO的摩尔比为1 : 1。简而言之，TEOS按顺序添加2N HNO3和无水乙醇分别搅拌一个小时。将适量的Ca(NO3)2·4H2O加入到上述溶液中，混合溶液搅拌1小时。(HNO3+H2O)-TEOS-乙醇溶液的摩尔比分别为10 : 1 : 10。将得到的溶胶溶液密封在一个烧杯中，于60 ℃的烘箱中干燥2天，120 ℃的烘箱中再干燥2天得到干凝胶。将干凝胶在800 ℃下煅烧4 h，等炉内温度降至室温后，制得粉末。将制得的粉末过300目的筛子，用于下一步实验。该方法的优点就是原材料纯度高，不像在波特兰水泥制造使用的那样[13]。

1.2 β-硅酸二钙水泥的水化过程

β-硅酸二钙水泥的水化过程就是个碳化过程。为了制备该种水泥，蒸馏水作为液相用于混合粉末，将制得的β-Ca2SiO4粉末与蒸馏水混合成均匀的水泥浆料均匀的涂抹在烧杯的四壁，液粉比(L/P)为2 ml/g。混合之后，将该水泥养护在37℃、100%湿度环境下养护5 h。然后将CO2气体通入该泥浆中，以3000 ml/min的速率通入90 min，为了去除残余的溶剂，将上述的泥浆在110 ℃条件下干燥一天，最终制得含球霰石β-硅酸二钙水泥。在该项研究中，V0指纯的β-Ca2SiO4水泥，V1指含球霰石β-Ca2SiO4水泥。将V0和V1粉末和Na2HPO4以0.8 ml/g的液固比混合，将得到的混合物填充到圆柱形不锈钢模具中(Φ 6 mm × 12 mm)，放入湿度为100%，温度为37 ℃的养护箱中养护24 h。

1.3 SBF浸泡后水泥的性能

为了提高体外理化性能，在37 ℃的条件下，该圆形柱试样(Φ 6 mm × 3 mm)浸泡在11-mLSBF中(pH值 = 7.40) ，试样表面积和SBF溶液体积比为0.1 cm2/mL[14]。该SBF制备方法根据Kokubo和Takadama所描述的程序进行[15]。为了研究球霰石对生物活性的影响，试样分别浸泡在SBF中3d。在浸泡SBF之前，V0和V1试样都放置在37 ℃、100%湿度的恒温箱中水化一天。浸泡3d后，将试样从离心管中取出，用去离子水和丙酮溶液轻轻地冲洗三次，于60 ℃烘箱中干燥24 h，进行相组成和结构的分析。同样为了验证球霰石是否能成功的消除Ca(OH)2的影响，将V0和V1粉末和SBF溶液以5 ml/g的液粉比混合于离心试管中，浸泡3d后，离心取上层液体，使用pH计(PHSJ-3F上海杰晟科学仪器有限公司)分别测量出V0和V1的pH值。

1.4 测试与表征

X射线衍射分析(XRD，Geigerflex, Rigaku,Japan)用来分析相结构，扫描电子显微镜(SEM,S-4800,JEOL, Tokyo, Japan) 配以能谱(EDS)来分析物质的结构和化学成分。傅里叶变换红外光谱(FTIR,Nicolet,Nexus 670)进一步分析物质的化学组分和化学键。将水泥试样养护在37 ℃，湿度为100%的恒温恒湿养护箱中，根据测试水泥的标准：ISO 9917-1，使用吉摩尔针(Gillmore needle，B001)测试水泥的凝结时间，本实验测试的凝结时间为终凝时间，即从混合开始到吉摩尔针不能在样品表面的3个不同区域留下1mm凹痕的这段时间。测试结果取8个试样的平均值±标准偏差。

2 结果和讨论

2.1 含球霰石水泥的相组成和形貌

V0和V1的XRD图谱如图1所示。从V0的XRD图谱中可以看出，在2θ = 18.021, 34.061，47.101处的是Ca(OH)2峰[15]。在2θ = 37.51处的弱峰对应的是CaO[12]。 此外，2θ = 29 °处出现的衍射峰[16]，对应的是水化硅酸钙相(C-S-H)即β-Ca2SiO4的不完全反应的无机相组成。然而，从图中很明显的看到，在引入CO2后即(V1), Ca(OH)2的特征峰消失了，CS-H的峰也变弱了。此时，球霰石的特征峰也成了水泥的主峰之一。2θ = 24.91, 27.01, 32.81，43.81,50.11处对应于球霰石的衍射峰 (JCPDS no. 33-0268)[5]。2θ = 23.301, 31.161, 32.181, 34.31, 41.31处对应的是β-Ca2SiO4的衍射峰。总的来说，在引入CO2后，Ca(OH)2和CO2反应，生成球霰石[17]。

如图2所示，通过FTIR对V1和V0的结构进一步分析。对V0试样，可以观察到3400 cm-1和1640 cm-1处有红外吸收峰, 这主要是由O-H和H-OH伸缩振动引起的[18-19]，而造成该伸缩振动的原因则是水化硅酸钙吸收水分造成的。800-1000 cm-1处的吸收峰主要是由Ca2SiO4中的Si-O伸缩振动造成的。而对于V1试样，我们可以观察到在744.4，874.2，1084.4和1465.7 cm-1处出现了新的红外吸收峰，这些峰的出现主要是由于球霰石中C-O的伸缩弯曲振动造成的[20]。

图3(a)是V1表面的SEM微观图像。可以观察到V1表面有一些球形的球霰石颗粒。相比较于图3(b)V0的SEM图像，很明显并没有观察到这些球形颗粒。

Fig.1 XRD patterns of β-Ca2SiO4 cement prepared after hydration for 1 day:V0 without introducing CO2 gas and V1 with introduced CO2

Fig.2 The FT-IR spectra of β-Ca2SiO4 cement prepared after hydration for 1 day: (V0) without introduced CO2 gas and(V1) with introduced CO2

使用能谱对球形粒子的组成进行进一步的表征，表征结果如图3(c)，能谱的结果显示粒子中存在Ca, Si, O, C元素，而其中的Ca, O, C元素的存在则意味着样品中含有球霰石，而Si的存在可能是残留的Ca2SiO4造成的。

球霰石的形成机理如下。当β-Ca2SiO4与水混合，β-Ca2SiO4首先开始水化，水化过程按照下面的反应式进行[22]：

球霰石是碳酸钙的一种晶型，当引入CO2到β-Ca2SiO4水化过程中，β-Ca2SiO4的水化产物Ca(OH)2将会与CO2反应，最终生成球霰石。反应过程如下：

2.2 含球霰石水泥的凝结时间

Fig.3 SEM micrographs of V1 (a) and V0 (b) cement surfaces prepared after hydration for 1 day； (c) EDS spectrum of spherical particles in Fig. 3(a)

与对照组V0相比(之前研究工作, 27 ± 2 min)，水泥水化后，凝结时间明显降低至12 ± 2 min[12]。可以看出，球霰石会加速水泥的凝结过程。从图1的XRD中可以得到这个结论。在水化改性后，V1中Ca(OH)2的特征峰消失了。同时，球霰石和β-Ca2SiO4的特征峰成了V1水泥的主峰。这与FT-IR的分析结果是相一致的。所以球霰石会加速凝结。此外，粉末颗粒的尺寸，烧结温度，相组成，溶剂和液固比也对骨水泥材料的凝结时间起着至关重要的作用[22]。

2.3 SBF浸泡后水泥表面HAp的形成以及pH值的变化

SBF浸泡是检验材料HAp形成能力最常用的方法[23]。图4是V0和V1水泥试样在SBF溶液中浸泡前后的表面形貌。从图4(a)和(c)中可以看出V0和V1水泥试样在浸泡前是没有羟基磷灰石的。然而，图4(b)和(d)分别是SBF浸泡3d后的图，可以看出，V0水泥表面被部分羟基磷灰石覆盖，而V1水泥完全被羟基磷灰石覆盖。对图4(d)中球形颗粒进行EDS能谱分析(图4(e))。从能谱中可以看出，SBF浸泡3d后，V1试样表面含有Si, Ca, P等元素。根据pH计测得的V0和V1的pH值分别为：12.16，9.79。pH值的迅速降低表明了V0水泥在水化过程中产生的Ca(OH)2能和CO2充分反应，从而成功的消除Ca(OH)2的碱性对材料带来的不利影响。

Fig.4 SEM micrographs of V0 cement surface before (a) and after (b) being immersed in SBF for 3 days, V1 cement surface before (c) and after (d) being immersed in SBF for 3 days； (e) EDS spectrum of spherical particles in Fig. 4(d)

图5 (V0)和(V1)分别是V0和V1骨水泥在SBF浸泡后的X射线衍射分析图。通过索引各自的标准JCPDS卡片(CSH，29-0378；β-Ca2SiO4，29-0371，HAp，09-0432)，确定试样是水化硅酸钙(CSH)，β-Ca2SiO4，HAp的混合物。从XRD图中可以看到，V0和V1水泥试样都含有磷灰石，表明它们有很高的生物活性。从图5(V0)看出,V0水泥只有在2θ = 31.74处有HAp[15]的衍射峰，但对V1来说，在2θ = 31.441，31.741，35.471和50.01[12,15,24,25]处都有HAp衍射峰，且峰更明显更尖锐，表明V1水泥试样有更好的生物活性。

使用FT-IR进一步分析V0和V1水泥试样HAp的形成能力，如图6(V0)和(V1)所示，1640 cm-1处的吸收峰是典型的H-OH伸缩振动，主要是由于水化硅酸钙(C-S-H)吸收水分造成的。1415 cm-1和841 cm-1处的吸收峰是由CO32-的C-O伸缩振动引起的[26]。965 cm-1处的吸收峰主要归因于PO3-4对称伸缩振动[25]。PO3-4的特征峰证明了V0水泥在SBF溶液中浸泡3 d后，试样表面沉积了HAp[9-26]。此外，图6 (V1), 在1062 cm-1处出现了新的PO3-4的P-O键的伸缩振动，即V1水泥试样拥有更佳的诱导羟基磷灰石形成的能力。结果表明，球霰石可以提高磷的吸附能力，加速HAp的形成。

Fig.5 XRD patterns of V0 and V1 cements after being soaked in SBF for 3 days

Fig.6 FT-IR spectra of V0 and V1 cements after being soaked in SBF for 3 days

3 结 论

这是一种简单且绿色环保的合成方法，能成功的合成出含球霰石β-硅酸二钙骨水泥。该方法不仅能够很好的消除β-Ca2SiO4骨水泥的水化产物Ca(OH)2给生物材料带来的不利影响，而且能降低水泥的凝结时间。体外研究表明含球霰石β-硅酸二钙骨水泥在SBF浸泡后能更好的诱导HA的形成。同时，合成的含球霰石水泥作为理想骨修复替代材料拥有极好的生物活性以及合适的凝结时间。接下来，我们还要着重研究Ca(OH)2转化为球霰石的速率，凝结时间，机械性能以及体外生物活性来确定将来的应用领域。